Aquí, presentamos un protocolo que describe la fabricación de elástico, doble canal, órgano chip microfluídico célula cultura dispositivos Recapitulando a nivel órgano funcionalidad in vitro.
Artículo de método
Fabricación escalable de elástico, doble canal, Chips microfluídicos órgano
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Resumen
Resumen
Un número importante de compuestos de plomo falla en la tubería farmacéutica porque estudios en animales a menudo no logran predecir la respuesta clínica en pacientes humanos. Humanos órgano-en-un-Chip (Chip de órgano) de la célula cultura dispositivos microfluídicos, que proporcionan una plataforma experimental en vitro para evaluar la eficacia, toxicidad y perfiles farmacocinéticos (PK) en seres humanos, pueden ser mejores predictores de eficacia terapéutica y seguridad en la clínica en comparación con los estudios en animales. Estos dispositivos pueden utilizarse para modelar la función de prácticamente cualquier tipo de órgano y fluídicamente pueden vincularse a través de microcanales de revestimiento de endotelio común para llevar a cabo estudios en vitro en fisiología humana nivel de órgano y conjunto a nivel de cuerpo sin tener que realizar experimentos en la gente. Estos Chips de órgano consisten en dos canales de microfluidos perfusión separados por una membrana elastomérica permeable con células parenquimatosas de órganos específicos en un lado y el endotelio microvascular, que puede estirar cíclicamente para proporcionar órgano-específicas señales mecánicas (p. ej., respiración de movimientos en el pulmón). Este protocolo detalla la fabricación de canal dual, flexible, Chips de órgano a través de la fundición de piezas utilizando 3D impreso moldes, permitiendo la combinación de varios casting y pasos de procesamiento posterior. Polietileno poroso (siloxano dimethyl) membranas (PDMS) se echan con micrómetro de tamaño agujeros utilizando silicio Pilar bajo compresión. Fabricación y montaje de órganos consiste en equipos y medidas que pueden aplicarse fuera de una sala tradicional. Este protocolo ofrece a los investigadores acceso a tecnología de Chip de órgano en vitro estudios a nivel de órganos y cuerpo en el descubrimiento de medicamentos, seguridad y eficacia de prueba, así como estudios mecanicistas de los procesos biológicos fundamentales.
Introducción
Aquí, describimos la fabricación de doble canal, dispositivos de cultura microfluídicos de órgano-en-un-Chip (Chip de órgano) vascularizados mediante un protocolo escalable dispuesto para el uso de grupos de investigación que carecen de acceso a salas blancas y herramientas de litografía blanda tradicional. Estos dispositivos se han desarrollado para recapitular humanas funciones órgano de comprensión normal y fisiología de la enfermedad, así como droga las respuestas in vitro1,2. Crítica a la ingeniería de esta funcionalidad son dos canales de microfluidos perfundidos, separados por una membrana semi....
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Protocolo
1. general preparación
- Para evitar desperdicios, limpiar área de trabajo con cinta de embalaje y limpiar con trapo para salas blancas y alcohol isopropílico.
- Para todos los pasos que requieren PDMS, mezcla de PDMS en una proporción 10:1 (10 g de Cruz enlazan a agente, 100 g de elastómero base). Mezcle a mano o con un mezclador disponible en el mercado. Utilizar un mezclador planetario centrífugo aquí: mezclar durante 2 minutos a 2000 rpm, luego desgasificar el PDMS por 2 minutos a 2200 rpm.
- Limpia todos los moldes con pistola de aire para soplar antes de utilizar los desechos.
PRECAUCIÓN: No use pinzas metálicas para q....
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Resultados
El protocolo que presentamos describe la fabricación escalable de PDMS órgano Chips. Estos dispositivos permiten el cultivo de dos tipos de distintos tejidos perfundidos en una membrana porosa elástico (figura 1). Los canales PDMS son fundición utilizando moldes de impresión 3D, que acelera la creación de prototipos de nuevos diseños (figura 2A y 2B). Canales superiores se echan en los moldes por compresión contr.......
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Discusión
El proceso de fabricación se basa en moldes impresos 3D de alta resolución al patrón el PDMS superior e inferior órgano cuerpo componentes junto con membranas PDMS porosas micromolded. Este enfoque crítico fue seleccionado debido a la facilidad de prototipos combinado con la rápida transición hacia mayor fabricación y sustitución de herramientas. Los moldes principales componentes están diseñados para puertos de patrón en lugares precisos con perfiles definidos durante la etapa de fundición. Esto no sólo evita la mano de.......
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Divulgaciones
D.E.I. es fundador y tiene acciones en emular, Inc. y preside su Consejo Asesor científico. J.P. es actualmente un empleado de emular, Inc. R.N., Y.C., J.P., y D.E.I. son inventores sobre propiedad intelectual que ha sido licenciada a emular, Inc.
Agradecimientos
Agradecemos a M. Rousseau y S. Kroll para obtener ayuda con la fotografía y videografía Ingram M., J. Nguyen, D. Shea y Wen N. contribuciones al desarrollo de protocolo de fabricación inicial. Esta investigación fue patrocinada por el Instituto Wyss para biológicamente inspirado de ingeniería en la Universidad de Harvard y la Defense Advanced Research Projects Agency bajo acuerdos cooperativo #W911NF-12-2-0036 y #W911NF-16-C-0050 y FDA concesión # HHSF223201310079C, subvenciones de NIH R01-EB020004 # y #UG3-HL141797-01, y la Fundación Bill y Melinda Gates concede #OPP1163237 y #OPP1173198 a DEI. Las opiniones y conclusiones contenidas en este documento son las de los ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo de protección individual | |||
| Redecilla para el cabello | VWR | 89107-770 | |
| Bata de laboratorio Tyvek | VWR | 13450-506 | |
| Guantes de puño extendido | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Tapete de corte | VWR | 102096-430 | |
| Cortador de azulejos | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Moldes superiores de molde en el lugar (MIP) | Protolabs, Inc. | impreso a medida | inferiores Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) | Protolabs, Inc. | impreso a medida | en Prototherm 12121 |
| Pinza curva Pico de pato | VWR | 63041-864 | |
| Pinza de punta afilada | Microscopía electrónica Sciences | 72700-D | |
| Espátula metálica | VWR | 82027-528 | |
| Grabado iónico reactivo profundo (DRIE) obleas de matriz de pilares | Sensera, Inc. | Personalizado | Cuatro matrices de pilares de 50 x 50 mm por oblea; pilares de 7 mmm de ancho, 50 mmm de alto, espaciados hexagonalmente a 40 mm |
| de distancia Policarbonato texturizado de .01" de espesor | McMaster-Carr | 85585K33 | cortado a bloques |
| cuadrados de PDMS de 45 mm (40 x 40 x 5 mm) | n/a | Campana | |
| fundido internamente | Germfree | BVBI | |
| de aire comprimido60 y grados; Horno | |||
| Desecador | |||
| Precisión del balance | de hasta 0,1 g | ||
| Máquina de plasma | Diener | La | capacidad de plasma de nano oxígeno es crítica |
| Suministros | |||
| Sylgard 184 poly (dimetilsiloxano) (PDMS) base/kit de agente de curado | Ellsworth Adhesives& nbsp; | ||
| Vaso | Garantice una ventilación adecuada al manipular prepolímeros debido a los bajos niveles de etilbenceno | ||
| Jeringa de 1 ml | VWR | 10099-395 | |
| Toallitas para salas limpias | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm portaobjetos de microscopio de vidrio VWR | 48311-703 | ||
| Cinta de embalaje | VWR | 500043-724 | |
| Cinta adhesiva | VWR | 500026-873 | |
| Tiras de poliuretano (PU) troqueladas Atlantic | Gasket, Inc. | Personalizado: AGWI2X3 | 1/8" grueso; Poliuretano negro de 60 durómetros; 2" x 3" |
| Película de policarbonato de .005" de espesor | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| placas de Petri cuadradas cuadradas de 100 x 100 x 15 mm | VWR | 60872-480 | |
| Papel | |||
| Opcional Equipo | |||
| Thinky Mezclador PDMS | Thinky | ARE-310 | |
| Plantilla de molde en el lugar (MIP) | Plantilla de | compresión de abrazadera de tornillo | |
| Fabricante automatizado de membranas (AMF) | Matriz de pistones de compresión neumática interna |
Referencias
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al.
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Reimpresiones y permisos
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Formal Correction: Erratum: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips
Posted by JoVE Editors on 5/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips. The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.
In the Representative Results section, the legend for Figure 5 has been updated from:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µL/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. Error bars indicate standard error of the mean.
to:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µl/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. The apparent permeability (Papp, cm/s) of the microporous PDMS membrane was determined using the dye concentration in the outlet channels. The gut chip cell layers provide a significantly increased barrier to permeability. Error bars indicate standard error of the mean.
In the Discussion section, the fourth paragraph has been updated from:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 4). The following equation can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel and is derived from equations used primarily for Transwell studies19,20 and corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by comparing the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
to:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 5). The following equation derived by Tran, et al.19 can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel, which partially corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by averaging the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
The References section has been updated from:
- Blaser, D.W. Determination of drug absorption parameters in Caco-2 cell monolayers with a mathematical model encompassing passive diffusion, carrier-mediated efflux, non-specific binding and phase II metabolism. at <http://edoc.unibas.ch/655/1/DissB_7998.pdf> (2007).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E.G.E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).
to:
- Tran, T.T. et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108–2123 (2004).
- Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).