Un método eficiente de tamizado para aislar intactos glomérulos del riñón de rata adulta

El glomérulo es un penacho altamente especializado de capilares responsables de la filtración del plasma de la circulación. Forma el principio de la nefrona, que es la unidad funcional básica del riñón. Función glomerular se define por un endotelio capilar fenestrado únicamente, el diafragma de la raja de podocitos y una intervención de la membrana basal. Estas capas forman una barrera semipermeable para permitir la excreción selectiva de sustancias en el líquido filtrado. Agua, iones y otras moléculas pequeñas generalmente pasan, mientras que moléculas más grandes son retenidas en el plasma. Podocitos son células epiteliales especializadas que extensión sobre la membrana del sótano, que rodean los capilares con proyecciones citoplásmicas conocidas como procesos de pie. Los pies de podocitos adyacentes entre los procesos y son atravesados por diafragmas de abertura conformadas por proteínas como la nefrina podocin, P-cadherin y ZO-1¹. En sección transversal, estos pies procesos uniformemente se arreglan sobre la membrana basal. En glomérulos enfermas, los procesos de pie convertido en grueso anormal o "borrado", llevando a pérdida anormal del contenido del plasma en el filtrado. Como tal, daño glomerular generalmente se caracteriza por la presencia de cantidades anormalmente grandes de proteína (p. ej., proteinuria) o glóbulos rojos (por ejemplo, hematuria) en la orina. Además, lesionados podocitos pierden expresión de nefrina como su regulador Wilms Tumor 1 (WT1), una proteína clave responsable de mantenimiento de diferenciación^2,3. Los glomérulos son un objetivo principal de daño en la nefropatía diabética y otras glomerulonefritis como enfermedad con cambios mínimos, nefropatía membranosa, glomerulosclerosis segmentario focal. Estas enfermedades son causas principales de insuficiencia renal progresiva y el desarrollo de insuficiencia renal, una condición en la que la supervivencia depende de la diálisis o trasplante renal. Por lo tanto, es importante para el estudio de glomérulos para comprender mejor la patología de la enfermedad (ERC) renal crónica.

Un sistema de cultivo de células es fundamental para estudiar biología glomerular. Debido a su papel central en la generación del diafragma de la hendidura, así como la existencia de enfermedades específicas proteinuria debido a las mutaciones de la proteína de membrana raja, mucha investigación ha utilizado lógicamente el Podocito en aislamiento. Esto ha llevado a la generación de líneas de celulares Podocito primario a utilizar en la vitro. Estas células pueden ser cultivadas bajo una variedad de condiciones y pueden cultivarse incluso en soportes permeables para evaluar permeabilidad de⁴. Sin embargo, el aislamiento de células proliferantes a menudo selecciona dedifferentiated las células que han perdido algunos de sus marcadores del Podocito. Esto ha llevado a la generación de podocytes condicional inmortalizadas derivadas de una cepa de ratón transgénico con un mutante sensible a la temperatura del SV40 grande T gen (p. ej. immortomouse), que podría cultivarse en cultura sino también ser diferenciada para expresar una amplia gama de Podocito marcadores⁵. Estos métodos de cultivo primario han sido fundamentales en la comprensión Podocito biología^4,6,7.

Sin embargo, culturas que contiene tipos de la célula solo falta las relaciones intercelulares que se producen en vivo así como la estructura de soporte y matrices, y monocapas de estas células no necesariamente recapitular tridimensional arquitectura de glomérulos. Los podocytes inmortalizado también puede ser incómodo y desafiante a la cultura⁸y requiere la posesión de cualquiera de los dos el immortomouse o una alícuota a partir de células de establecido los investigadores para empezar. Además, el glomérulo se compone de no sólo podocitos, pero también las células endoteliales capilares y la membrana basal, así como células mesangiales que proporcionan soporte para la estructura. Por lo tanto es útil para desarrollar un ex vivo enfoque disponible para todos los investigadores para el estudio de glomérulos intactos que conservan su arquitectura original, así como todas las células que constituyen el glomérulo normal.

En 1958, Cook y Pickering describieron el primer aislamiento de glomérulos del riñón de conejo. Después de observaciones que la embolia grasa se convirtió en alojado en glomérulos, postuló que las partículas del mismo tamaño podrían utilizarse para aislar específicamente estas estructuras. De hecho, la infusión de partículas de óxido de hierro en la condujo a la captura de estas partículas en los glomérulos del riñón. Después de la disociación mecánica y tamizado del riñón, los glomérulos se podía aislados intacto y con la pureza mediante separación magnética⁹. En 1971, Misra demostró que el óxido de hierro infusiones pueden ser omitidas y el aislamiento glomerular con tamizado de picada humano, perro, conejo o rata de tejido de riñón¹⁰. Esta técnica se ha modificado desde entonces dependiendo de la meta de los investigadores pero esencialmente ha dado lugar a preparaciones purificadas que podría ser más estudiado o de que las culturas de célula primaria podrían ser establecido^{11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}.

Aquí se describe un protocolo para el aislamiento de glomérulos intactos viables del riñón de rata. El conjunto del protocolo toma unas pocas horas. Aunque no proliferan, planes experimentales de cualquier tamaño se pueden apoyar simplemente aumentando el número de riñones como material de partida. Aunque hay protocolos publicados para la separación del grano magnético de glomérulos, requiere una inyección intravenosa de granos, son más caros y puede alterar la biología ya que los granos se conservan bien por los glomérulos en la cultura o requieren glomerulares" lisis"y extracción por centrifugación¹⁹. En comparación con glomérulos de ratón, el mayor tamaño de los glomérulos de la rata (cerca de 100 μm en dos meses las ratas¹⁸) hace mucho más fácil de separar de otras estructuras del riñón mediante una simple técnica de tamizado.

Como evidencia de su utilidad, hemos caracterizado los glomérulos para demostrar los diferentes tipos de células. También pueden estar expuestos a agentes conocidos a glomérulos en vivo, y demuestran los efectos adversos del sulfato de protamina (PS) sobre estas culturas. PS es un POLICATIÓN que neutraliza los sitios aniónicos a lo largo de la pared capilar glomerular²⁰. Esta neutralización tiene un efecto dramático sobre la barrera de filtración glomerular y por lo tanto aumenta la proteinuria y pie effacement de proceso. Estos glomérulos pueden ser evaluadas con immunoblots para proteínas clave como la nefrina y WT1 para evaluar la salud general. Además, su estructura se puede evaluar con luz, inmunofluorescencia y microscopía electrónica.

En general, este protocolo es accesible a la mayoría de los investigadores (uno sólo necesita acceso a los animales y algunos equipos sencillos). Con características morfológicas salió indemnes, el investigador es capaz de analizar los glomérulos y ver cómo otros tipos de células importantes y preservación de la matriz en los glomérulos afectan la progresión de la función y enfermedad, un defecto de las culturas del Podocito.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Pittsburgh.

1. aislamiento de glomérulos de rata

1. Para preparar un buffer de aislamiento estéril de 1%, añadir 5 g de albúmina de suero bovino (BSA) a un vaso de precipitados de 600 mL.
   1. Añadir 500 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) en el vaso y agite con una varilla magnética hasta que se disuelva todo BSA.
   2. Filtro estéril el búfer de BSA/PBS 1% en una campana de cultivo celular.
      Nota: El buffer de BSA/PBS estéril 1% puede conservarse a 4 ° C por hasta una semana.
2. Obtener 2 a 4 ratas Sprague-Dawley pesando 150 a 200 g cada uno.
   1. Eutanasia ratas mediante dióxido de carbono inhalación usando un compartimiento en el cual se introduce dióxido de carbono 100% a una velocidad de 10-30% del volumen de la cámara por minuto. Observar animales para el cese de la respiración y desapareció el color de los ojos antes de la eliminación de dióxido de carbono.
   2. Preparar la piel sobre el abdomen anterior con etanol al 70% y utilizar cortar el pelo para eliminar el vello, si lo desea. Haga una incisión de línea media en la piel con tijeras quirúrgicas o bisturí. Hacer otra incisión de línea media a través de la capa muscular para exponer los órganos internos. Extender la incisión superior a través de la membrana y esternón o costillas como un método secundario de la eutanasia.
   3. Aislar y retirar ambos riñones y coloque en un tubo cónico plástico estéril de 50 mL con 30 mL de solución salina tamponada Hanks (HBSS) en hielo.
      Nota: Varias ratas pueden ser sacrificadas en la misma cámara y de los riñones puede ser colocado en el mismo tubo cónico.
3. Mantener los riñones en el hielo y transporte a una campana de cultivo celular estéril. Transferir los riñones a una placa Petri estéril que contiene 5 mL de HBSS, también sobre el hielo, retire y deseche grasa perirrenal con tijeras y afiladas pinzas. Si persiste, también Retire y deseche la cápsula que rodea el riñón haciendo una incisión superficial y luego use pinzas afiladas que tire del órgano.
   Nota: Siempre mantenga riñón aislados en hielo y práctica técnica estéril en todo. Un trozo de gasa estéril se puede colocar en el plato de Petri como una superficie con textura para mantener el riñón en su lugar durante la manipulación.
   1. Cortar los riñones por la mitad longitudinalmente (sección midsagittal) Retire y deseche la médula (que es más oscura en color) con un bisturí en una segunda placa de Petri con 5 mL de HBSS.
   2. Transferir las piezas restantes, que son predominantemente la corteza renal, en un tercer plato de Petri con 5 mL de HBSS y pique con una hoja de afeitar estéril hasta que las piezas son menos de 1 mm de tamaño, o hasta que se forma una pasta.
4. Mojar la parte superior e inferior de un tamiz de 180 μm, con 1% BSA/PBS sobre un vaso de precipitados de 500 mL residuos. Este paso es esencial ya que cubre el tamiz con la proteína y reduce la adherencia de los glomérulos, que mejorará el rendimiento.
5. Pon la corteza picada en un pequeño borde del tamiz y mush el tejido a través del tamiz en un recipiente de fondo sentado en hielo la brida de émbolo con textura (la opuesta a la Junta de goma) de una jeringa de 10 mL. Lavar periódicamente con HBSS pero utilizar lo menos posible para evitar la dilución de la muestra.
   Nota: No exceda 30 mL del total buffer, tan sólo 25 mL más pueden utilizarse aquí. La razón para colocar el tejido picadito en solamente un extremo del tamiz es para reducir la adherencia de glomérulos por limitar la exposición a parte del tamiz, en lugar de la superficie de tamiz entero.
   1. Para facilitar esto, reutilizar el líquido recoger en la bandeja para enjuagar el tamiz. Una vez tamizado, lavar cuidadosamente la parte inferior del tamiz con tampón de BSA/PBS 1% del fondo de la cacerola para capturar cualquier glomérulos que pueden ser adheridas libremente.
   2. Recoger todo el líquido en el recipiente inferior en varias jeringas de 10 mL, equipadas con agujas de 20 G y pasarla a través de la aguja al menos 2 veces más. En la última colección, mantenga el líquido que contiene los glomérulos en la jeringa hasta que esté listo para pasar por el tamiz de 90 μm.
6. Mientras que el líquido se almacena en las jeringuillas, lave la bandeja inferior por lavado con 1% BSA/PBS en inútil vaso y moja la parte superior e inferior de un tamiz de 90 μm, con 1% BSA/PBS. Coloque el cestillo encima de la bandeja de hielo.
   1. Aplicar la muestra en la jeringa a un borde del tamiz y mush por el tamiz con otra brida de jeringa como describir por encima. Lavar con solución de la bandeja inferior para recoger todo en un borde del tamiz.
   2. Una vez tamizado es completo, lavar cuidadosamente la parte inferior del tamiz como en el paso 1.5.1. Recoger todo el líquido en la bandeja inferior de un tubo plástico cónico de 50 mL.
7. Lave la bandeja inferior con 1% BSA/PBS en un vaso de residuos y moja la parte superior e inferior de un tamiz de 75 μm, con 1% BSA/PBS. Coloque el cestillo encima de la bandeja de hielo.
   1. Aplique la muestra en un borde del tamiz. Líquido debe fluir a través fácilmente. Enjuague por la parte superior con al menos 20 mL de 1% BSA/PBS en el vaso de residuos. Lavar cuidadosamente la parte inferior del tamiz así. Los glomérulos se mantendrá en la parte superior de este tamiz de 75 μm.
   2. Uso HBSS para recoger glomérulos en una placa Petri de enjuague a través del tamiz boca abajo. Hacer tanto HBSS según sea necesario. Recoger en una o más 50 mL plástico cónico o los tubos en hielo.
8. Centrifugue a 1800 x g durante 5 min a 4 ° C, retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender el precipitado en 10 mL de HBSS frío. Combinar las muestras se recogieron múltiples tubos cónicos en 1.7.2. Repita el paso de centrifugación.
9. Resuspender los glomérulos en 5 mL de HBSS hasta que esté listo para proceder al siguiente paso.
10. Si lo desea, tome un recuento de los glomérulos totales. Para esto, tomar un 10 μl de muestra con una pipeta y coloque la gota en un portaobjetos de vidrio. Ver bajo el microscopio, contar los glomérulos en el campo y multiplique por 500 para obtener el rendimiento total.
    Nota: Pureza puede determinarse contando el número de túbulos en el campo y dividiendo por el número total de glomérulos y túbulos estructuras. Debe haber glomérulos de > 95% en el campo visual.
    1. Si hay contaminación tubular significativa, repita los pasos 1.6.1 hacia adelante y no se olvide de lavar bien cuando completar paso 1.7.1. Este es el paso en que la contaminación tubular es más probable que ocurra.

2. lesiones de los glomérulos

1. Recoger los glomérulos en un tubo cónico de plástico de 15 mL y un spin abajo a 200 x g. resuspender en una cantidad apropiada de HBSS, basado en el rendimiento total que hay aproximadamente 9.000 glomérulos por pozo. Pipetee 450 μl de muestra en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, o requiera de cualquier formato de placa que se ajusta a los ensayos posteriores.
   Nota: Pipeteo arriba y abajo para mezclar los glomérulos en tampón garantiza una solución homogénea. Los glomérulos son muy pegajosos y pesados y pegarse entre sí, y se colocan en la parte inferior de una solución rápida y a los lados del tubo.
2. Para hacer protamina de 6 mg/mL sulfato de solución (PS), en primer lugar disolver 1 g de PS en 10 mL de dH2O calentada a 40 ° C en un tubo cónico de plástico de 15 mL y agitar bien. 30 μl de la solución y añadir a 470 μl de dH2O.
   Nota: Esto producirá una solución de 6 mg/mL, y cuando se añaden 50 μl al pozo como se describe a continuación, la concentración final es de 0.6 mg/mL.
   1. Por duplicado, añada 50 μl de sulfato de protamina (esto es un 1:10 dilución) a cada pozo de un grupo, mientras que proporciona otro grupo 50 μl de HBSS (control negativo).
3. Incube la placa durante 4 h a 37 ° C.
4. Girar por el contenido de cada pocillo en un tubo de microcentrífuga (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) y lavar dos veces con 1 mL de PBS por cada.
5. Aspirar fuera del último lavado y resuspender en 300 μL de PBS. Dividido en tres alícuotas para aislamiento de proteína, visualización de transmisión microscopio electrónico (MET) y la inmunofluorescencia (si) la coloración.

3. preparación de glomérulos para análisis

1. Girar hacia abajo el contenido de los tres alícuotas (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) y aspirado de buffer restante y proceder al análisis de muestras por TEM, IF, o el aislamiento de la proteína.
2. Procesamiento para TEM
   1. Fijar pellets glomerulares en 150 μL de frío glutaraldehído al 2.5% en PBS de 0.01 M. Quite el fijador cuidadosamente el sedimento con una pipeta Pasteur, asegurándose de no perturbar el sedimento, luego lavado con PBS y después fijarlo en tetraóxido de osmio 1% con Ferricianuro de potasio 1%.
   2. Deshidratar la muestra a través de una serie gradual de etanol (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) y óxido de propileno luego incrustar en la incrustación de material epoxi.
   3. Corte semi fino (300 nm) secciones en un ultramicrótomo. Mancha con 0.5% de azul de toluidina en borato de sodio 1% y examinarlas bajo el microscopio óptico.
   4. Cortar secciones ultrafinas (65 nm), tinción con acetato de uranilo y citrato de plomo de Reynold y examinar en un microscopio electrónico de transmisión.
3. Proceso pues si
   1. Añadir 150 μL de una gelatina de 12% en solución de PBS y colocar inmediatamente en hielo seco para formar un pellet. Remoje la pelotilla en 500 μl de 2% paraformaldehído/1 x PBS en un tubo de microcentrífuga durante la noche a 4 ° C.
   2. Colocar el sedimento en un molde de base e integrar mediante la adición de medio de temperatura (OCT) de corte óptimo en hielo seco. Corte secciones de 5-10 μm en un cryotome y proceda con inmunofluorescencia/inmunohistoquímica o manchas histológicas estándar.
4. Para el aislamiento de la proteína
   1. Añadir 150 μL de tampón de RIPA a pellet glomerular centrifugada con 1,5 μl de inhibidor de la proteasa y dounce con Homogenizadores de tejido.
   2. Proceder a la cuantificación de la proteína y immunoblotting u otros análisis de la proteína.

El protocolo desde el momento de la eutanasia al aislamiento de los glomérulos puede terminar adentro tan poco como 2 h y tiene un alto rendimiento y eficacia. Con la utilización adecuada de la técnica, el rendimiento de glomérulos por riñón de rata oscila entre 6.000-10.000 glomérulos cuando a partir de los 8 riñones. La suspensión final atestada de glomérulos y tiene una total pureza > 95%, con mínima contaminación de segmentos tubulares u otros tipos de células (figura 1A, B). Además, los glomérulos OCT incrustado pueden teñirse con las manchas Hematoxylin y eosina (H & E) para ver la morfología (figura 1C). Estos glomérulos mantienen su estructura a lo largo de todo protocolo, incluso después de su transformación. Demostramos que los glomérulos aislados poseen podocytes intacto y viable (figura 2A), las células mesangial (figura 2B) y células endoteliales (figura 2C).

Una vez aislados, los glomérulos pueden estar expuestos a lesiones químicas bien conocidas para simular patología en vivo . En este caso, sulfato de protamina (PS) fue elegido por su capacidad para interrumpir la carga de la barrera de filtración glomerular, que finalmente conduce al borramiento de proceso del pie. Glomérulos PS tratados tienen una llamativa reducción de nefrina (rojo) y un número de núcleos positivos para WT1 (verde) mediante inmunofluorescencia (figura 3A, B). Los glomérulos pueden prepararse también para microscopía electrónica de transmisión (figura 3C). Muestras de control tienen morfología normal del Podocito y procesos del pie mientras que los glomérulos PS tratados effacement de proceso piefigura 3D, que es un signo de disfunción del Podocito y se ve en vivo modelos PS21. Esto correspondió también a una disminución de la nefrina por immunoblotting (figura 3E, F).

Para determinar viabilidad, exfoliados caspasa-3 se evaluó como un marcador de apoptosis. Mediante inmunofluorescencia, exfoliados caspasa-3 aparece por primera vez en algunas células a partir de 2 h después de aislamiento (figura 4). El número de células que expresan esta proteasa se convirtió en más abundante con el tiempo, con los más altos niveles en 24 y 48 h. Esto sugiere que la apoptosis se produce relativamente temprano en la cultura y que aplicaciones posteriores deben realizarse poco después de aislamiento para obtener mejores resultados.

Figura 1 . Aspecto típico de las culturas glomerular rata después aislamiento. (A) imagen trasmitida de cultura glomerular. Aunque hemos elegido un campo en el que hay un solo túbulo renal en esta micrografía (flecha), las culturas obtenidas son generalmente > 95% puro. Barra de escala es igual a 100 μm. (B) imagen ampliada de un solo glomérulo. (C) tinción de hematoxilina y eosina de un solo glomérulo. Barras de escala en B y C igualan a 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Tipos de células constituyentes se conservan en los glomérulos aislados. Microscopia de la inmunofluorescencia confocal fue realizada para que nefrina (rojo, podocitos) y marcadores específicos de células para identificar podocitos, células mesangiales y el endotelio. (A) Costain nefrina y WT1 (verde, podocitos). (B) Costain nefrina y PDGFR-β (verde, células mesangiales, flecha). (C) Costain nefrina y CD31 (células endoteliales, los vasos de la sección transversal caracterizada por puntas de flecha). Barra de escala = 25 μm en todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 . Lesión del Podocito puede ser inducida en vitro con glomérulos aislados de rata. (A) la microscopia de la inmunofluorescencia Confocal para nefrina y WT1 en una cultura glomerular sin tratar. Tenga en cuenta la nefrina lineal (rojo) la coloración y la presencia de núcleos de WT1-positiva (verde) que se consideran típicamente cuando hay podocytes saludable. (B) después de Protamina sulfato tratamiento, expresión de la nefrina es disminuida y no lineal, y WT1 está ausente, indicando lesión del Podocito. Procesos de pie (C) proyección de imagen de transmisión electrónica microscpy (TEM), membrana basal y un endotelio fenestrado típico de estructura glomerular normal. La barra es igual a 500 nm. (D) después de sulfato de protamina, procesos de pie son alargados o borrados (puntas de flecha), que indica lesión del Podocito. (E) Western blot para nefrina muestra había disminuido nephrin después del tratamiento de sulfato de protamina. Actina (F) control para western blot de carga aparece. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 . Evaluación de la viabilidad celular en glomérulos aislados. Se realizó microscopía confocal de la inmunofluorescencia para exfoliados caspasa-3 (verde). Una mancha de la nefrina fue realizada para localizar fácilmente los glomérulos. Mientras que no había exfoliada caspasa-3 la positividad en 0 y 1 h después de aislamiento de glomérulos, señal de fluorescencia en algunas células fue observado en 2 h. progresivamente que más células vuelta positiva más tiempo después de aislamiento que fueron examinados. El mayor número de células positivas de caspasa-3 fueron observado a las 24 y 48 h. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.