PCR cuantitativa de bacteriófago T7 de Biopanning

Resumen

Reproducible, exacto y tiempo eficiente cuantitativo PCR (qPCR) describe un método para enumerar bacteriófago T7 es aquí. El protocolo describe claramente la preparación de ADN genómico de fago, preparación de reacción de PCR, qPCR ciclismo condiciones y análisis de datos qPCR.

Resumen

Este protocolo describe el uso de la PCR cuantitativa (qPCR) para enumerar fagos T7 de experimentos de selección de fagos (es decir, "biopanning"). qPCR es un enfoque basado en la fluorescencia para cuantificar ADN, y aquí, se adapta a cuantificar genomas de fagos como proxy para las partículas de fago. En este protocolo, se describe un método de preparación de DNA de fago fácil usando calefacción de alta temperatura sin purificación adicional de ADN. El método sólo necesita pequeñas cantidades de phages tratada térmicamente y volúmenes pequeños de la reacción de la qPCR. qPCR es alto rendimiento y rápido, capaz de procesar y obtener los datos de una placa de 96 pocillos de reacciones en 2 – 4 h. en comparación a otros métodos de enumeración de fagos, qPCR es más eficiente en tiempo. Aquí, qPCR se utiliza para enumerar fagos T7 identificadas biopanning contra vitro moco de la fibrosis quística como modelo. El método de qPCR puede ampliarse para cuantificar fagos T7 de otros experimentos, incluyendo otros tipos de biopanning (e.g., proyección de fago inmovilizada la Unión a proteínas, in vivo ) y otras fuentes (por ejemplo, los sistemas de agua u otros líquidos corporales). En Resumen, este protocolo puede modificarse para cuantificar cualquier virus ADN encapsulado.

Introducción

Tecnología de visualización de bacteriófagos (fagos), desarrollada por George Smith en 1985, es un enfoque potente y alto rendimiento para identificar péptidos o proteínas ligandos contra objetivos o receptores de la membrana celular, antígenos de la enfermedad, organelos celulares o específicos órganos y tejidos en los últimos dos décadas^1,2. Aquí, al azar bibliotecas de polipéptidos o anticuerpos de cadena simple se muestran en las proteínas de la capa de phages (típicamente M13 o T7) y ligandos específicos pueden ser identificados de bateo contra proteínas inmovilizadas en vitro o en vivo ....

Protocolo

1. primer diseño y análisis de ADN genómico de fago T7

1. Diseño de cebadores para la amplificación de la DNA genomic de fago T7.
   Nota: F (delantero) y R (reversa) cartillas (véase Tabla de materiales) amplifican la secuencia de la DNA T7 situado aguas arriba de la región variable de la biblioteca (figura 1).
2. Elegir un analizador de la cartilla apropiada para evaluar los parámetros de los iniciadores, incluyendo punto de fusión (Tm), por ciento contenido de GC (% GC), dímeros de primer, horquilla formación y adecuación PCR (figura 1).
3. Los oligonucleótidos de cart....

Resultados

Herramientas de diseño de la cartilla diferentes pueden utilizarse para diseñar primers qPCR. Por lo general, primer diseño programas tienen sus propios incorporados algoritmos para calcular y validar los parámetros clave de cartillas, por ejemplo, GC %, Tm, dimer de cartilla o formación de horquilla, etc. generalmente, los criterios claves son similares en diferentes herramientas de diseño de la cartilla y cartillas pueden diseñarse siguiendo sus instrucciones. Primer e.......

Discusión

Desarrollamos métodos de qPCR para cuantificar phage genoma ADN⁵y aquí describimos y adaptado un método de qPCR para enumerar T7 phages seleccionados contra una barrera de moco similar a CF. Información mínima para las directrices de publicación de cuantitativa en tiempo real PCR experimentos (MIQE) fueron adaptados para desarrollar y validar el método de qPCR para enumeración de fagos T7¹⁵. El protocolo que hemos desarrollado para cuantificar los phages de biopanning exper.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materials and Reagents
embalaje DNA	EMD Millipore	69679-1UG
MicroAmp óptico placa de reacción de 96 pocillos	ThermoFisher Scientific	N8010560
Mezcla maestra de qPCR--Potencia la mezcla maestra SYBR Green	Biosystems aplicada	A25742
Kit de película adhesiva óptica MicroAmp	ThermoFisher Scientific 4313663
T7Select 415-1 Cloning Kit EMD	Millipore	70015	Protocolos de usuario : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP
Solución DNase I	ThermoFisher Scientific	90083
Placa de transpocillos de 24 pocillos	Corning	3472
UltraPure DNasa/Libre de RNasa Destilada H2O	Invitrogen	10977015
solución salina tamponada con fosfato (1x)	Corning	21040CV
strong>Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Equipments
ViiA7 Sistema de PCR en tiempo real con bloque rápido de 96 pocillos	Microcentrífuga ThermoFisher Scientific	4453535
Heraeus Pico 21	ThermoFisher Scientific	75002415
Fisherbrand Mezclador de vórtice digital	Fisher Scientific	02-215-370
Calentador multibloque HERMO SCIENTIFIC Modelo de	ThermoFisher Scientific	:2001
Centrífuga Sorvall Legend X1 Rotor		ThermoFisher Scientific
M-20	ThermoFisher Scientific	75003624
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Software
QuantStudio Software de PCR en tiempo real	ThermoFisher Scientific		v1.2
de cebadores qPCR en tiempo real	IDT
OligoAnalyzer 3.1	IDT

Primers for T7 genomic DNA IDT F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT T7 Seleccionar control de < de cubeta oscilante de microplaca 75004220 Diseño