Reacción en cadena digital de la polimerasa (PCR) es una herramienta útil para la detección de alta sensibilidad de variantes de un solo nucleótido y ADN copia número variantes. Aquí, demostramos las más importantes consideraciones para la medición de variantes raras en el genoma mediante PCR digital con el formato de chip en tubo.
Artículo de método
Digital de la reacción en cadena de polimerasa para la variación genética en un paciente de la poliposis adenomatosa familiar esporádico con el formato de Chip en tubo
En este artículo
Resumen
Resumen
Los análisis cuantitativos de la variación genética humana es crucial para la comprensión de las características moleculares de condiciones médicas serias, tales como tumores. Porque las reacciones en cadena digital de la polimerasa (PCR) permite la cuantificación precisa del número variantes de ADN copia, se están convirtiendo en una herramienta esencial para detectar las variaciones genéticas raras, como las mutaciones resistentes a los medicamentos. Se espera que diagnóstico molecular mediante PCR digital (dPCR) estará disponible en la práctica clínica en un futuro cercano; por lo tanto, cómo llevar a cabo eficientemente dPCR con material genético humano es un tema candente. Aquí, presentamos un método para detectar mosaicism somático poliposis adenomatosa coli (APC) con el formato de chip en tubo, que permite ocho reacciones de dPCR a realizarse simultáneamente de dPCR. Debe tenerse cuidado al llenado y sellado de la mezcla de reacción en las fichas. Este artículo muestra cómo evitar la sobre y subestimación de las particiones positivo. Además, presentamos un procedimiento simple para recoger el producto de dPCR de las particiones en las fichas, que luego pueden utilizarse para confirmar la amplificación específica. Esperamos que este informe de métodos ayudará a promover la dPCR con el método de chip en un tubo en la investigación genética.
Introducción
PCR cuantitativa (qPCR) con frecuencia se utiliza para cuantificar la variación genética humana, incluyendo variantes de un solo nucleótido (SNVs) y variaciones de número de copia de DNA (CNVs). En qPCR, una reacción de la polimerasa se realiza en cada tubo de la misma manera como en la PCR de punto final convencional, y una señal de amplificación se adquiere del tubo después de cada ciclo térmico. Por el contrario, dPCR, dPCR punto final en este informe, lo que significa la mezcla PCR se carga en muchos compartimientos microscópicos, llamados particiones, que son plantillas de la DNA o ausentes o presentes en una dilución limitante y cada partición que contiene mezcla PCR se evalúa como negativo o positivo después de la polimerización en cadena completa. Mientras que es fácil de estimar que hay no hay plantillas de la DNA en las particiones negativo, no está claro cuántas copias de plantillas de la DNA están presentes en las particiones positivo. Por lo tanto, el número de plantillas de la DNA en las particiones positivas se estima en base a la distribución de Poisson, utilizando la cuenta de la negativa de las particiones1. dPCR es más caro y tiene un rango dinámico más pequeño en comparación con qPCR, pero este método permite una cuantificación absoluta y ofrece una mayor sensibilidad y mayor precisión2.
Una de las principales aplicaciones de dPCR es la validación de las variantes identificadas por secuenciación de próxima generación (NGS). Especialmente en el caso de variantes raras, fracciones variante baja de significado, la validación es crucial debido a los errores de secuencia que pueden ocurrir en NGS3. Mientras que Sanger secuenciación y qPCR son herramientas útiles para la validación del SNVs y CNVs, su sensibilidad es baja en comparación con el dPCR. Por lo tanto, dPCR tecnología es en la demanda de estudios de genética con variantes raras. Recientemente, la detección por biopsia líquida de variantes raras relacionadas con características de cáncer, tales como resistencia a los fármacos, se ha convertido en un tema candente en diagnóstico molecular y terapia4. La tecnología de dPCR aparece adecuada para estudios de biopsia líquida y se espera que tenga importantes aplicaciones clínicas en un futuro cercano, aunque mejoras relacionadas con el rango dinámico y costo se requiere implementar.
Tecnología dPCR comercialmente disponibles se puede categorizar áspero en plataformas basadas en la gota y chip; la diferencia es como las plantillas de la DNA son particiones5,6,7. En la dPCR con formato de chip en tubo, la mezcla PCR se distribuye por acción capilar en las particiones en un chip. Las fichas están construidas en tubo de ocho tiras, que muchos funcionarios de laboratorio ya estarán familiarizados con, y, así, ocho muestras pueden tratarse en un tiempo de8. En el paso de la lectura, toma < 1 h para el tratamiento de 96 muestras detectando la imagen entera de la viruta y no cada partición. Desde dPCR con el formato de chip en tubo tiene un rendimiento alto comparado con otros sistemas de dPCR, usabilidad y productividad son las principales ventajas para sus usuarios.
En este informe, mosaicism somático del gen APC en un paciente con poliposis adenomatosa familiar esporádico se utiliza como un caso representativo y se comparan los resultados de dPCR y NGS. El objetivo principal de este informe es cuantificar claramente una variante de un solo nucleótido dPCR con el formato de chip en tubo. Esperamos que este informe sea útil para los investigadores interesados en la adopción de la plataforma de dPCR para su propio trabajo.
Protocolo
El diseño del estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la escuela de medicina del Universidad de Hamamatsu (G-260-4). Consentimiento informado escrito fue obtenido de la paciente y sus padres.
1. Control de calidad de la DNA Genomic
Nota: El DNA genómico (gDNA) fue extraída de sangre periférica usando el método de purificación basado en la membrana de silicona bien establecido ADN. Antes de la a continuación de los procedimientos, la concentración del gDNA se determinó usando un espectrofotómetro.
- Preparar la muestra gDNA en una concentración de 10-100 ng/μl.
- Añadir 10 μl de solución tampón de muestras de ADN a una tira de tubo 8.
- Añadir 1 μl de ADN escalera o gDNA en los tubos. Vórtice la mezcla durante 1 min, utilizando el accesorio de la microplaca.
- El tubo de carga, la gel dispositivo de puntas en la electroforesis (Tabla de materiales) del instrumento y comenzar el funcionamiento pulsando el botón 'Start'.
Nota: El sistema de electroforesis operará automáticamente con un clic en el botón Inicio. - Confirmar que el marcador más bajo en el tampón de muestra de ADN está correctamente asignado en el electropherograms. Si incorrectamente se asigna, asignar manualmente el marcador en el 'modo de Electroherogram' del software.
Nota: El número de integridad de ADN (DIN) se calculan automáticamente. El valor DIN viene de la integridad del ADN. Alta y baja DIN valores indican gDNA muy intacto y fuertemente degradado, respectivamente. - Especificar la región tamaño de gDNA (> 200 bp) en el 'modo de región' del software para calcular automáticamente la concentración de gDNA (> 200 bp).
2. imprimación y diseño de la sonda
- Calcular los valores de temperatura (Tm) fusión usando cualquier herramienta de acceso abierto bajo las siguientes condiciones: 10 – 25 bases, 50 mM Na+k+, 0.80 mM dNTPs y 3 mM de Mg2 + (Tabla de materiales). Diseño de los cebadores para amplificar la región genómica que contienen alelos de destino con el valor dem de T alrededor de 60 ° C y la longitud del amplicón en 100 – 300 bp hacia adelantados y hacia atrás.
Nota: Refiérase a la tabla 1 para la concentración de los oligonucleótidos. - El ácido nucleico bloqueado (LNA) sondas para los alelos de referencia y la variante de diseño basado en las siguientes condiciones: (i) 1-6 LNAs están presentes en cada sondeo; (ii) un colorante fluorescente y un quencher están presentes en el 5'- y 3'-terminales de cada sonda, respectivamente; (iii) la diferencia entre los valores dem de T de los sondeos coincidentes y no coincidentes es > 10 ° C; (iv) Tm los valores de las sondas coincidentes y no coincidentes son más altos y más bajos que los de los iniciadores, respectivamente [p. ej., primer avance: 60,8 ° C, primer revés: 59,8 º C, sonda alelo de referencia (que empareja/no coinciden): 62.6/45.3 ° C, la variante sonda de alelo (que empareja/no coinciden): 61.7/50.5 ° C]. Se calcularon los valores dem de T usando la herramienta de acceso abierto también se utiliza para el paso 2.1.
- Asegúrese de que el diseño de primers y sondas no abarcan los polimorfismos de nucleótido simple con una frecuencia de > 0.1% según lo determinado de bases de datos [p. ej., la base de datos de polimorfismos de nucleótido único (dbSNP)].
3. de digital PCR
- Preparar las primers, sondas y gDNA soluciones en las concentraciones descritas en la tabla 1 con un buffer TE y almacenar a -20-4 º C.
-
Mezclar los reactivos a temperatura ambiente en un volumen total de 15 μl a una concentración final como se describe en la tabla 1.
- Agregar 3 μl de agua destilada en lugar de gDNA en un control de plantilla no (NTC).
- Preparar 3.5 x la cantidad de la mezcla PCR por triplicado para tener en cuenta el error de pipeteo.
- Pipetear la mezcla PCR arriba y abajo para mezclarlo.
- Establecer la plataforma de carga en las fichas construidas en la franja de 8-tubo y ponlos en el autocargador. Asegurar que exista un contacto entre la viruta y la plataforma de carga.
- Colocar un regulador de carga en la plataforma y mantenga el control deslizante con el tapón de la cargadora.
- Pipetear 15 μl de la mezcla PCR en la plataforma cerca de la punta de la botella (figura 1A).
- Ejecutar el loader presionando el botón del cargador (para aproximadamente 1 minuto).
Nota: No es un problema si queda una pequeña cantidad de la mezcla PCR en la plataforma. Es posible volver a ejecutar secuencialmente el cargador. - Establecer el viruta-en-un-tubo llenado con la mezcla de PCR en la ranura lateral de enhancer sellado. Empuje la tapa de la diapositiva y el borde de la tapa superior para no romper el chip (figura 1B).
- Ejecute el optimizador de sellado (aproximadamente 2 min). Secuencialmente, vuelva a ejecutar el optimizador de sellado durante 1 minuto si un charco de líquido sigue siendo visible debido a un cierre incompleto provoca una contaminación cruzada de las señales positivas (figuras 1C y 1D).
- Añadir 230 μl de líquido, un reactivo a base de aceite, los tubos del lacre.
Nota: Las fichas ahora deben ser sumergidas en el líquido. - Coloque los tubos en el termociclador. Ejecute al termociclador como se describe en la tabla 2 (por aproximadamente 2 h). Ajustar la temperatura o la duración de la PCR si hay una distribución desigual de las particiones positivas (figura 1E).
Nota: Se recomienda ajustar la tasa de rampa a alrededor de 1 ° C/s. - Dejar los tubos en el termociclador durante al menos 15 min para reducir el ruido de línea de base.
Nota: Los tubos pueden dejarse durante la noche así. Señales de fluorescencia fueron detectadas hasta el día siguiente. - Coloque los tubos en la plantilla de detección y vierta 6 mL de agua destilada en la plantilla. Si las burbujas de aire son visibles dentro y fuera de los tubos, claro ellos (figuras 1F y 1 G).
- Cargar la plantilla en el detector y ejecútelo con un clic en el botón 'Ejecutar' del software después de la selección de fichas Fluorescene, experimento y muestra/NTC (Tabla de materiales).
Nota: La detección de color doble de ocho muestras con una intensidad de defecto toma aproximadamente 4-5 minutos. - Confirman la trama de la posición, histograma y diagrama 2D scatter.
Nota: iIf la intensidad de fluorescencia de las particiones negativo es alto, regular la intensidad con un clic en el botón de configuración del software para que caiga dentro del rango de 30 – 70. - Calcular la fracción de alelo variante (VAF) utilizando la siguiente fórmula:
Aquí, el Cv y Cr son los números de copia de la variante y el alelo de la referencia, respectivamente.
Nota: Que se calculan automáticamente en el programa de software basado en las estadísticas de Poisson.
4. recogida del producto de PCR
- Retire el líquido sellado del tubo.
- Añada 100 μl de buffer TE al tubo. Vortex vigorosamente por 30 s y brevemente Centrifugue el tubo.
- La solución TE la transferencia a otro tubo y añadir 30 μl de acetato de sodio de 3 M y 200 μL de etanol.
- Enfriar la solución a-20 ° C durante la noche.
- Centrifugue la solución durante 30 min a 16.000 x g y eliminar el sobrenadante.
- Añadir 300 μL de etanol al 80% y el tubo de vórtice.
- Centrifugue la solución durante 15 min a 16.000 x g y eliminar el sobrenadante. Permitir que el precipitado secar durante 5 minutos.
- Después de secado al aire para disolver el precipitado en 1 a 5 μl de tampón TE.
- Si es necesario, evaluar el tamaño del producto utilizando un instrumento de electroforesis con referencia a paso 1. Carga de 1 μl de la solución para el dispositivo de gel para una sensibilidad alta (Tabla de materiales).
Resultados
Repasamos mosaicism somático del gen APC en un paciente con poliposis adenomatosa familiar esporádico según los procedimientos descritos anteriormente. En un estudio previo, la APC c.834 + 2T > C mutación fue encontrada en el paciente, pero no en sus padres, utilizando Sanger secuenciación y NGS9. Los diseños de los cebadores y sondas en los resultados representativos se muestran en la tabla 3. ADN genómico fue extraído de la sangre del proband, los padres y seis donantes sanos. Los valores del estruendo de las nueve muestras gDNA a 6.7 – 7.9 (figura 2 y tabla 4). FAM y hexagonal fueron utilizados como los tintes de fluorescencia para los alelos C y T, respectivamente. Los puntos verdes y amarillos en las parcelas de posición representan particiones FAM-positiva y HEX-positiva, respectivamente (figura 3A). Los puntos azules representan particiones negativo para FAM y hexagonal. El fondo negro corresponde a las particiones donde no se ha añadido la mezcla de reacción. Muchas particiones positivo de los alelos C y T fueron detectadas en el proband, mientras que algunas particiones positivo del alelo C fueron detectadas en padre del proband o del CNT y, en las particiones de la T positivo, este último alelo no se detectaron. La separación de la señal entre los alelos C y T fue clara en el diagrama de dispersión bidimensional de (2-D), y las señales más positivas de HEX y FAM fueron exclusivos de otros (figura 3B). La VAF el proband fue 13,2%, que es similar a la determinada con NGS (12,7%) (Tabla 4). Las VAFs el proband padres y donantes sanos fueron < 0.1%. El límite de detección para la APC c.834 + 2T > mutación de C era estimada para ser 0.3% usando 3 x la desviación estándar para las mediciones repetidas con 10 – 11 ng del gDNA total10.
El tamaño del amplicón en el ensayo de dPCR APC c.834 + 2T > C fue predicho para ser 123 bp. Para confirmar que el producto de dPCR fue amplificado como una sola banda, el producto de dPCR fue recogido desde el chip ensayado. Mediante electroforesis, claramente se detectó una sola banda, y el tamaño del producto es consistente con la predicción (figura 4).
Figura 1 : Puntos para el ensayo de dPCR con viruta-en-un-tubo formato. (A) este panel muestra cómo establecer la franja de 8 tubos en el autocargador. (B) este panel muestra chips rotas. (C) este panel muestra cómo la viruta superficies justo después de (i) carga y sellado (ii). (iii) un charco de líquido es visible en el caso de un cierre incompleto. (D) este panel muestra la representación gráfica de la posición en el caso de una contaminación cruzada. (E) este panel muestra la representación gráfica de la posición en el caso de una distribución desigual. (F) este panel muestra como burbujas en la superficie del tubo sumergido en el agua. (G) este panel muestra las burbujas de aire dentro del tubo. A lo largo de la figura entera, blanco y negro puntas de flecha indican las piezas chip roto y burbujas, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Electropherograms representante de sangre gDNA. Electropherograms de sangre gDNA con DIN valores de 6.7 y 7.9 se muestran en la parte superior y el panel inferior, respectivamente. El asterisco indica un marcador inferior. DIN: Número de integridad de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Resultados representativos de APC mosaicism somático con el formato de chip en tubo de dPCR. (A) la posición de las parcelas y diagramas de dispersión (B) del plantilla de no control (NTC), el proband y el padre se muestran aquí. HEX y FAM corresponden a las referencia y la variante de alelos, respectivamente. Líneas verticales y horizontales indican los umbrales de intensidades HEX y el FAM, respectivamente. Esta figura ha sido modificada de Kahyo et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Colección de productos de dPCR desde el chip ensayado. Los productos de dPCR recogido y concentrado fueron sometidos a electroforesis. El tamaño de destino prevista fue de 123 PB. Esta figura ha sido modificada de Kahyo et al. 10. NTC: plantilla de no control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | Concentración de solución madre | Volumen (μL) | Concentración final | Recomienda concentración final |
| Libre de DNasa/Rnasa agua destilada | - | 1.75 | - | - |
| 2 x PCR Master mix | - | 7.5 | - | - |
| Sonda LNA para importante alelo | 2 ΜM | 0.5 | 66,7 nM | 3.33 – 100 nM |
| Sonda LNA para alelo menor | 2 ΜM | 0.5 | 66,7 nM | 3.33 – 100 nM |
| Primer avance | 1 ΜM | 0.5 | 33.3 nM | 3.33 – 50.0 nM |
| Primer revés | 1 ΜM | 0.5 | 33.3 nM | 3.33 – 50.0 nM |
| 20 x solución de dPCR | - | 0.75 | - | - |
| gDNA | 3.33 ng/μL | 3 | 666 pg/μL | 20 pg/μL – 2.000 pg/μL1 |
Tabla 1: los reactivos utilizados para el ensayo de dPCR. 1 Dependiendo de la sensibilidad y precisión esperada.
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos de |
| Inicial desnaturalizar | 95 ° C | 5 m | 1 |
| Desnaturalizar Recocido y extensión | 95 ° C 58 ° C | 50 s 90 s | 42 |
| Extensión final | 70 ° C | 5 m | 1 |
Tabla 2: Condiciones de termociclador.
| Nombre | Secuencia1 | Tm valor2 |
| Primer avance | 5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 ' | 60,8 ° C |
| Primer revés | 5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 ' | 59,8 ° C |
| Sonda LNA para el alelo T | 5'-HEXAGONAL-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3' | Emparejado: 62,6 ° C No coinciden: 45,3 ° C |
| Sonda LNA para el alelo C | 5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3' | Emparejado: 61,7 ° C No coinciden: 50,5 ° C |
Tabla 3: diseño de los cebadores y sondas de. 1 Letras entre corchetes y subrayadas son los LNA y variante específica, respectivamente. 2 Calculado según el paso 2 del protocolo.
| NGS3 | dPCR4 | |||||||
| Muestra1 | Tejido | Entrada de ADN (ng) | DIN2 | VAF (%) | Variante (copias) | Referencia (copias) | VAF (%) | |
| Significa | DSR | |||||||
| NTC | - | - | - | - | 1.23 | 0 | N / A | N / A |
| Proband | Sangre | 11.3 | 7.6 | 12.7 | 379 | 2.48 x 103 | 13.2 | 0.0353 |
| Padre | Sangre | 10.3 | 7.7 | 0.0167 | 1.08 | 3.42 x 103 | 0.0341 | 0.439 |
| Madre | Sangre | 10.8 | 7.6 | 0,0136 | 0.956 | 3.04 x 103 | 0.0313 | 0.637 |
| Donante-1 | Sangre | 11.7 | 7.3 | - | 1.64 | 3.01 x 103 | 0.0543 | 0.414 |
| Donante-2 | Sangre | 10.5 | 7.6 | - | 1.06 | 2.90 x 103 | 0.0406 | 0.539 |
| Donante-3 | Sangre | 17.6 | 7.9 | - | 4.24 | 5,65 x 103 | 0.0713 | 0.783 |
| Donante-4 | Sangre | 12.3 | 7.6 | - | 2.38 | 4.16 x 103 | 0.0666 | 0.557 |
| Donante-5 | Sangre | 19.2 | 7 | - | 1.48 | 6.79 x 103 | 0.0213 | 0.571 |
| Donante-6 | Sangre | 14.4 | 6.7 | - | 3.44 | 4.67 x 103 | 0.0728 | 0.729 |
Tabla 4: resultados de la dPCR ensayo para APC mosaicism somático. 1 NTC: plantilla de no control; Donante: donante sano. 2 DIN: Número de integridad de ADN. 3 Iwaizumi et al. 9, var. hum genoma 2 15057 (2015). 4 Los experimentos se ejecutaron en triplicado e independientemente repetidas x 3; los datos se expresan como el valor medio; RSD: desviación de estándar relativa; N/A: no aplicable. La tabla ha sido modificada de Kahyo et al. 10.
Discusión
El valor DIN a menudo se utiliza para evaluar el ADN dañado (por ejemplo, gDNA del tejido parafina-encajado formalina-fijo) antes de la cuantificación o la secuencia, porque puede producir una degradación avanzada de gDNA datos de baja calidad. Evaluación DIN es, convirtiéndose así, en un paso importante en el control de calidad del gDNA humana11. Desde gDNA utilizado en el experimento representativo había almacenado a 4 ° C durante 4-11 años después de su extracción de sangre, sus valores DIN se determinan en un control de calidad antes del ensayo de dPCR. Este paso es recomendable especialmente si los materiales son sospechosos de ser dañado. También se determinó la concentración de gDNA por electroforesis. Porque el rango dinámico de dPCR no es tan amplio como para qPCR debido a las limitaciones de las particiones, una medición de la concentración del gDNA es un paso importante para un ensayo de dPCR exitosa. Como la cantidad de ADN se correlacionó con el número de copia total de los alelos variante y referencia en el ensayo de dPCR de entrada (R-squared = 0,935; Tabla 4), es útil para medir la concentración del gDNA antes del ensayo de dPCR.
La carga y sellado de procesos son pasos importantes para resultados exitosos. Es crucial para confirmar el montaje adecuado de la mezcla PCR en la plataforma y asegurar el contacto entre la viruta y la plataforma (figura 1A). Protrusión de la mezcla PCR desde el regulador puede causar distribución no válido en el chip. Confirmando la distribución de las particiones en una parcela de posición positivas y negativas también es necesario un análisis preciso, porque se asume en las estadísticas de Poisson que plantillas de la DNA se reparten al azar en cámaras1. En los resultados representativos, particiones positivas se distribuyeron a lo largo de la viruta (figura 3). Este resultado cumple con el requisito para la estadística de Poisson y refleja que la carga y sellado de procedimientos fueron efectivos. Al fijar los tubos en el optimizador de sellado, las fichas podrían ser rotas si la porción central de la tapa superior es empujada muy fuertemente (figura 1B). Para evitar esto, empuje suavemente el borde de la tapa superior. Si hay un grupo artificial de particiones positivas (figura 1D), el número de copia puede ser sobrestimado debido a una contaminación cruzada entre las particiones. El proceso de sellado debe mejorarse si un charco de líquido es visible en la superficie (figura 1C) (p. ej., secuencialmente, volver a ejecutar el optimizador de sellado durante 1 minuto). Si hay una distribución desigual de las particiones positivas (figura 1E), se puede subestimar el número de copia debido a insuficiente amplificación o contaminación del líquido sellado y del agua. Las condiciones PCR deben ser ajustadas en este caso [por ejemplo, mediante la regulación de la temperatura o la duración de la polimerización en cadena (paso 3.11 del Protocolo), o garantizando que el lacre líquido y agua vertida en la plantilla están limpios]. Se detectan las señales de fluorescencia de la franja de 8-tubo sumergida en agua destilada. Si las burbujas de aire se adhieren a la superficie del tubo, hay la posibilidad que puede interferir con la detección de la señal (figura 1F). Por lo tanto, deben eliminarse burbujas utilizando una herramienta, como una pipeta fina. Además, las burbujas de aire pueden formar dentro de los tubos cuando se establecen en la plantilla (figura 1G). Si las burbujas dentro de los tubos son lo suficientemente grandes para el chip, ellos también deben ser liberados. Las burbujas pueden eliminar si se dejan por varios minutos a temperatura ambiente.
Algunas particiones positivo podrían detectarse en el CNT. Para evitar una contaminación de las plantillas de la DNA, limpiar el Banco y, si es posible, hacer un espacio con una unidad de filtro de ventilador. Si se sospecha una contaminación de las plantillas de la DNA, minuciosamente limpiar el espacio o deseche los reactivos usados. Por el contrario, si no se detectan las particiones positivo del alelo referencia en presencia del gDNA, confirmar las concentraciones del gDNA, cebadores y sondas. En particular, se utilizaron los iniciadores en una menor concentración en el experimento representativo, en comparación con el convencional PCR (tabla 1)12. También es crucial confirmar la tasa de rampa, que raramente es alterada en PCR convencional.
Qué hace dPCR con el formato de chip en tubo único es el repartir de la mezcla PCR dentro de la tira de tubo 8 universal8,13. Una transferencia de las cámaras de particionamiento en un tubo PCR no es necesaria en este sistema, reduciendo así el riesgo de contaminación. También hay una ventaja en el sistema de dPCR con formato de chip en tubo; toma < 4 h para terminar 96 ensayos en ese sistema de dPCR, mientras que tarda por lo menos 5 horas para terminar el mismo número de ensayos en dPCR basada en gota14. Además, la franja de 8-tubo universal permite el uso de un termociclador convencional, a diferencia de otros dPCR basada en chip15, que requiere a un termociclador con un bloque de plano. También, el conocimiento acumulado y reactivos para PCR convencional pueden aplicarse al sistema de dPCR. Esto será útil para ampliar las aplicaciones de dPCR.
Cabe señalar que dPCR tiene varias limitaciones. En dPCR con el formato de chip en tubo, el número de partición de la viruta es relativamente bajo en comparación con los de otras plataformas de dPCR. Otra mejora para el dispositivo de chip se requerirá aumentar el rango dinámico, que depende del número de particiones. Porque el espacio interno del tubo universal es limitado, un diseño innovador para el dispositivo de chip es necesaria para aumentar el número de particiones. La automatización del procedimiento dPCR todo en el futuro reducir errores humanos, dando lugar a resultados más confiables. Debido a su naturaleza de alto rendimiento y alta sensibilidad, se espera que la dPCR con formato de chip en tubo se aplica para tratar a un número de muestras para biopsias líquidas y ADN ambiental.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por subvenciones para Scientific Research (C) de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSP) (no. 15 K 08397) a Tomoaki Kahyo y por las subvenciones de la Agencia de Japón para investigación médica y desarrollo (AMED) (Nº 927960719), Subvenciones para la investigación exploratoria (no. 16K 15256), gasto para proyectos asociados de un presupuesto especial de incentivos para la promoción de una reforma de la Universidad Nacional en subvenciones de gastos de gestión (Nº 1019253) y la Fundación de investigación tabaco a Haruhiko Tomokazu. Los autores agradecen su apoyo clínico Dr. Iwaizumi y Dr. Kurachi. Los fundadores no tenían ningún papel en la preparación del manuscrito. Figura 3, figura 4y tabla 4 adaptado y reproducido de un artículo de Kahyo et al. 10, con permiso de Elsevier.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| QIAamp DNA Blood Maxi Kit | Qiagen | 51194 | Antes del Protocolo 1: Extracción de ADN genómico |
| NanoDrop 1000 | ThermoFisher SCIENTIFIC | ND-8000 | Antes del Protocolo 1: Espectrofotómetro |
| Tubo de 8 tiras | Agilent | Technologies 401428 Protocolo 1 | |
| Tampón de muestras de ADN genómico | Agilent Technologies 5067-5366 | Protocolo 1: Un componente de la escalera de ADN genomico de la cinta de cribado | |
| Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocolo 1: Un componente del ensayo de cinta de cribado de ADN genómico | |
| MS3 Basic Small Shaker | IKA | 3617000 | Protocolo 1: Mezclador de vórtice |
| Cinta de cribado de ADN genómico | Agilent Technologies | 5067-5365 | Protocolo 1: Dispositivo de gel |
| 2200 Sistema | TapeStationAgilent Technologies | G2965AA | Protocolo 1: Instrumento de electroforesis |
| Software de análisis TapeStation | Agilent Technologies | incluido con G2965AA | Protocolo 1: Software de análisis |
| Cedadores de oligonucleótidos de ADN | IDT | Pedido personalizado | IDT Protocolo 2 |
| Sondas LNA | IDT | Protocolo 2 | pedido personalizado |
| IDT | : http://biophysics.idtdna.com/ | Protocolo 2 | |
| dbBase de datos SNP | Sitio web del | NCBI | Protocolo 2 |
| Tampón TE | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12090015 | Protocolo 3 |
| Agua destilada sin DNasa/RNasa | ThermoFisher SCIENTIFIC | 10977015 Protocolo 3 (Tabla 1) | |
| Clarity Digital PCR Probe Mastermix | JN Medsys | 12013 | Protocolo 3 (Tabla 1): 2xPCR Master Mix Un componente del fluido de sellado Clarity #10011 |
| JN Medsys | 12005 | Protocolo 3: Fluido de sellado Un componente de #10011 | |
| Clarity JN Solution | JN Medsys | 12006 | Protocolo 3 (Tabla 1): Solución 20xdPCR Un componente de la tira de tubo Clarity #10011 |
| JN Medsys | 12007 | Protocolo 3: Chip-in-a-tube componente A del kit de carga de muestras Clarity #10011 | |
| JN Medsys | 12008 | Protocolo 3: Plataforma de carga y deslizador Un componente del #10011 | |
| Clarity Auto Loader | JN Medsys | 11002 | Protocolo 3: Cargador automático Un componente de #10001 |
| Clarity Sealing Enhancer | JN Medsys | 11003 | Protocolo 3: Potenciador de sellado Un componente de #10001 |
| Lector de claridad | JN Medsys | 11004 | Protocolo 3: Lector Un componente del termociclador #10001 |
| Life Eco | Bioer Technology | TC-96GHbC | Protocolo 3: Termociclador |
| Software Clarity | JN Medsys | incluido con #10001 | Protocolo 3: Software de análisis |
| Cinta de pantalla D1000 de alta sensibilidad | Agilent Technologies | 5067-5584 | Protocolo 4: Dispositivo de gel para alta sensibilidad |
Referencias
- Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10 (3), 0118833(2015).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355 (6326), 752-756 (2017).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1869-1875 (2017).
- Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057(2015).
- Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
- Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68 (2), 63-90 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
- Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
- Bio-Rad Laboratories. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
- Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).
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