Artículo de método

Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

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DOI:

10.3791/58216

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6 de septiembre de 2018

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1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

En este artículo

Resumen

Se describe un método para diseñar un retineano tejido compuesto de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de las células de vástago pluripotent humanas cultivadas sobre las membranas amnióticas humanas y su preparación para injerto en modelos animales.

Resumen

Varias condiciones patológicas del ojo afectan a la funcionalidad y la supervivencia del epitelio retiniano del pigmento (RPE). Estas son algunas formas de retinitis pigmentosa (RP) y degeneración macular senil (DMS). La terapia celular es una de las estrategias terapéuticas más prometedoras propuestas para curar estas enfermedades, con alentar ya resultados preliminares en seres humanos. Sin embargo, el método de preparación del injerto tiene un impacto significativo en sus resultados funcionales in vivo. De hecho, son menos funcionales que las misma células trasplantadas como un tejido retiniano células RPE injertadas como una suspensión. Adjunto, describimos un método simple y reproducible al ingeniero RPE tejido y su preparación para la implantación de una en vivo . Se siembran las células RPE derivadas de células madre pluripotentes humanas sobre un soporte biológico, la membrana amniótica humana (jamón). En comparación con andamios artificiales, este apoyo tiene la ventaja de tener una membrana del sótano que está cerca de donde se unen las células RPE endógenas la membrana de Bruch. Sin embargo, su manipulación no es fácil, y hemos desarrollado varias estrategias para su adecuado cultivo y preparación para injerto en vivo.

Introducción

RPE es crucial para la supervivencia y la homeostasis de los fotorreceptores con el cual está firmemente asociado1. Varias condiciones patológicas alteran su funcionalidad y supervivencia, incluyendo RP y AMD.

RP es un grupo de mutaciones monogénicas hereditarias que afectan a las funciones de los fotorreceptores o las células RPE o ambos2,3. Se estima que las mutaciones que afectan específicamente el RPE células representan el 5% de RP2. AMD es otra condición donde se altera la capa RPE, pérdida de visión central en última instancia a líder. AMD es causado por las interacciones complejas de factores genéticos y ambientales y afecta a los ancianos4,5,6. Según las proyecciones, AMD será un motivo de preocupación para pacientes 196 millones en todo el mundo por 20207. Para estos trastornos, no hay cura efectiva existe, y una de las estrategias propuestas es el trasplante de nuevas células RPE para compensar muerto/no funcional preexistente de las células RPE8.

El modo de formulación de los productos finales a ser injertada es esencial para asegurar los mejores resultados funcionales. Células RPE inyectadas como una suspensión, a pesar de ser un método fácil y sencillo de entrega, plantear inquietudes acerca de su supervivencia, integración y funcionalidad9,10,11,12 , 13. los científicos están preparando más formulaciones complejas para ofrecer ingeniería de tejido retiniano9,13,14,15,16. En este contexto, hemos desarrollado un método original para generar el en vitro RPE tejido que podría ser utilizado para trasplante9.

Los bancos de células RPE derivados de células madre embrionarias humanas (ES) se utilizan en el presente Protocolo. Sin embargo, la alternativa RPE célula bancos procedentes de diferentes células (células madre pluripotentes humanas, las células RPE primarias, etc.) y distinguido con un método diferente también son adecuados para este protocolo. Incluye diferenciación dirigida protocolos con citoquinas y moléculas pequeñas17,18,19,20,21,22.

Para ser trasplantado, el tejido diseñado debe estar preparado en un andamio. En los últimos años, diferentes andamios han desarrollado basado en un polímero o en una matriz de origen biológico13,23,24. Aquí, el sustrato biológico utilizado es el jamón, pero otros substratos, como membranas de Bruch denudadas, podrían ser implementados. El método descrito en el presente documento tiene la ventaja de usar un andamio biológico más relevante para el entorno nativo de RPE.

Células madre derivadas de células RPE embrionarias humanas se cultivan durante al menos 4 semanas para completamente organizado como una monocapa de adoquines. En ese momento, el epitelio obtenido es funcional y polarizado9. Por último, como este tejido se arruga fácilmente, está incrustada en una capa delgada de un portador de hidrogel para darle más rigidez y elasticidad y para protegerlo durante el procedimiento de inyección. Este producto se almacena a 4 ° C hasta el injerto.

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Protocolo

Todos los materiales humanos utilizados en el presente Protocolo se utilizaron según regulaciones de la Unión Europea. La línea humana de la célula ES utilizada en este estudio se derivó de un embrión único. La pareja que había donado el embrión completamente fue informada y dio su consentimiento para una donación anónima. Una línea de células de humano ES de tipo clínico fue derivada de este embrión, bancarizada, calificada y debidamente documentada por la células de Roslin (Reino Unido). Jamones fueron procurados en condiciones estériles durante una cesárea en madres que han firmado un consentimiento informado para la donación de placenta según las pautas del hospital (APHP, Hôpital Saint Louis).

1. preparación de medios de cultivo y reactivos

  1. Preparación de medio de cultivo de células RPE
    1. Para preparar el medio de cultivo de células RPE, agregar sustituto de suero de 4% (20 mL para un volumen final de 500 mL) x 1.000 diluido 2-Mercaptoetanol (500 μl de un volumen final de 500 mL) y solución de aminoácidos no esenciales 1% Eagle′s medio esencial mínimo (MEM) (5 mL para un final volumen de 500 mL) a la glucosa alta de modificado Eagle de Dulbecco medium (DMEM) (475 mL para un volumen final de 500 mL).
  2. Preparación del medio de transporte y conservación
    1. Para preparar el medio de transporte y conservación, añadir 1% de penicilina-estreptomicina (5 mL para un volumen final de 500 mL) a CO2-medio independiente (495 mL para un volumen final de 500 mL) y guardar a 4 ° C.
  3. Resuspensión de la enzima thermolysin
    1. Preparación de solución madre de thermolysin
      1. Para preparar una solución madre de thermolysin, descongelar el polvo thermolysin, que se almacenó a-20 ° C, a temperatura ambiente.
      2. Como la actividad enzimática puede variar de lote a lote, calcular esta actividad basada en el certificado de análisis con el polvo de thermolysin del lote a utilizar. Dividir la "actividad proteasa Neutral calculado = ANPC" (indicado en el certificado de análisis) por 181 (que es el peso molecular de tirosina). El resultado obtenido corresponde a la actividad enzimática total de la thermolysin suministrado en polvo (U/vial).
      3. Prepare una solución de 200 U/mL añadiendo el volumen de agua correspondiente a la total actividad enzimática (U/vial) dividida por 200 (U/mL).
      4. Disolver la enzima transfiriendo el agua que se agregó hacia arriba y hacia abajo. Vórtice la solución por 30 s y compruebe si el polvo totalmente ha sido suspendido. Pipeteo más puede ser necesario para una completa disolución.
      5. Alícuota de la solución y almacenar a-20 ° C.
    2. Preparación de una solución de trabajo de thermolysin
      Nota: La solución de thermolysin debe ser preparada en el día del tratamiento de jamón.
      1. Descongelar las alícuotas stock de thermolysin de 200 U/mL almacenado a-20 ° C. Diluya la solución stock 200 x en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una actividad enzimática final de 1 U/mL. Preparar 40 mL para tratar manchas de jamón de 1 – 4.
      2. Filtrar la solución de thermolysin a través de un previo de filtro 0.2 μm a utilizar.
  4. Resuspensión de gelatina
    1. Preparación de solución de gelatina 20% y el bloque
      Nota: La solución de gelatina 20% y el bloque se pueden preparar hasta 1 semana antes de su uso.
      1. Caliente el CO2-medio independiente a 42 ° C en un baño de agua durante 30 minutos (hasta 1 h). En un tubo de 50 mL, añadir 10 g de gelatina en 40 mL de CO2de calentado-medio independiente y agitar la solución.
      2. Disolver la gelatina durante 30 – 60 min a 42 ° C. Vortex cada 10 minutos para homogeneizar la solución.
      3. Una vez que la solución esté homogénea, añadir 4 mL de la solución de gelatina 20% a cuatro platos de cultura 6 cm. Evitar las burbujas. Añadir una película de parafina plástico para proteger los platos y deje que la solución solidificar a 4 ° C.
    2. Preparación de solución de gelatina 8%
      Nota: La solución de gelatina 8% puede preparada el día antes de su uso y almacenada a 4 ° C.
      1. Caliente el CO2-medio independiente a 42 ° C por 30 min (hasta 1 h). En un tubo de 50 mL, añadir 4 g de gelatina en 46 mL de caliente CO2-medio independiente y agitar la solución.
      2. Disolver la gelatina durante 30 – 60 min a 42 ° C. Agregar una película de parafina plástica para proteger el tubo y mantenerlo en un baño de agua a 37 ° C para ser utilizada el mismo día, o almacenar a 4 ° C para su uso posterior.

2. Thermolysin tratamiento de las membranas amnióticas humanas

  1. Lavado de la membrana amniótica humana
    1. Tienen jamones como pedazos pequeños (aproximadamente de 30 x 30 mm) fijada en un andamio de nylon, o ya en 4 ° C en PBS o congelado. Siempre congelado, descongelar las membranas a 37 ° C en una incubadora durante 30 minutos.
    2. Lavar las membranas:
      1. Colocar membranas de 1 a 4 en una botella de 250 mL conteniendo 80 mL de PBS. Utilizar tantas botellas como sea necesario.
      2. Agite cada botella en un agitador de placa a una velocidad alta durante 5 minutos, luego descartar el PBS. Agregar 80 mL de PBS y repita.
  2. Tratamiento Thermolysin
    1. Añadir 40 mL de la solución de trabajo de thermolysin (1 U/mL) por la botella que contiene las membranas (membranas de 1 – 4 por botellas; hasta 3 botellas a la vez).
    2. Agitar las botellas durante 5 minutos a 450 rpm y luego vortex por 30 s. repetir 1 x.
    3. Deseche la solución de thermolysin y añadir 80 mL de PBS.
    4. Agitar las botellas por 5 min a 450 rpm. Descartar el PBS y añadir 80 mL de PBS. Repetir x 3.

3. fijación de membranas amnióticas humanas en una inserción de la cultura

  1. Utilice pinzas largas estériles (que pueden llegar a la parte inferior de la botella) para quitar los jamones uno a uno y cada jamón de transferencia a un plato de cultura de 10 cm conteniendo 10 mL de PBS.
  2. En una nueva 10 cm placa de cultivo que contiene 10 mL de PBS, coloque una de las membranas con el nylon hacia abajo. Separar dos de los cuatro clips que se utilizan para fijar la membrana de nylon.
  3. Inserte el anillo más pequeño de la inserción de la cultura entre el nylon y la membrana.
  4. Asegúrese de que la membrana cubra completamente el anillo más pequeño. Clip de la segunda parte de la inserción de la cultura encima de la membrana. La membrana del sótano del jamón es hacia arriba dentro de la inserción de la cultura. Suelte los dos clips.
  5. Cortar con las tijeras estériles, el exceso de membrana fuera de la inserción de la cultura si es necesario. Mediante pinzas, transferir la membrana fija en la inserción de la cultura a una placa de 12 pozos, añadir PBS y guardar la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
  6. Repetir estas operaciones (del paso 3.2 a 3.5) con las otras membranas.

4. descongelación y siembra de células del epitelio pigmentario de la retina en las membranas amnióticas humanas

  1. Descongelación de células del epitelio pigmentario de la retina
    1. El Banco de células RPE se congela en 1 millón de células por viales criogénicos en nitrógeno líquido. Descongelar como muchos frascos criogénicos como sea necesario (se siembran las 350.000 células por membrana).
    2. Preparar un tubo de 15 mL que contiene 3 mL de medio RPE por vial criogénico. Una vez que el frasco se descongele, transferir las células a cada tubo. Repita esta operación para los otros frascos.
    3. Homogeneizar (pipeta hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para resuspender las células en el medio RPE) y tomar 10 μl de la solución celular y transferir a un tubo de 1,5 mL. Añadir 10 μl de azul tripán. Lugar 15 μl de esta solución en una cámara de conteo, entonces cuente el número de células viables (no coloreados en azul) bajo un microscopio con el objetivo 4 X. Repita esta operación para los otros frascos.
    4. Mientras tanto, centrifugar los tubos de 15 mL a 110 x g durante 5 min., descartar el sobrenadante y resuspender las células en 700.000 células/mL.
  2. Siembra de células del epitelio pigmentario de la retina en las membranas amnióticas humanas
    1. Retire la placa de 12 pozos que contienen las membranas de la incubadora.
    2. Aspire el PBS. Añadir 500 μl de la suspensión preparada en el paso 4.1.4 en el centro de la inserción de la cultura. Añadir 1 mL de medio RPE fuera de la inserción de la cultura (dentro del pozo). Repita para las otras membranas.
    3. Coloque la placa de 12 pozos que contienen las membranas en la incubadora.

5. mantenimiento de cultivos de células de epitelio pigmentario de la retina en las membranas amnióticas humanas

  1. Renovar el medio 2 x por semana, generalmente los lunes y el viernes, hasta por lo menos 30 días de la cultura.
  2. Aspire el medio dentro y fuera de la inserción de la cultura para cada pozo y renovar con medio fresco (1 mL fuera de la inserción de la cultura y 500 μl dentro). Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2.

6. preparación de la versión de epitelio pigmentario de la retina para el trasplante

Nota: A partir de 30 días de la cultura, el tejido está listo para el trasplante.

  1. Caliente la solución de 8% de gelatina en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos llenar la cámara interna de vibratome con frío CO2-medio de independiente (a 4 ° C).
  2. Coloque el bloque de gelatina 20% en el vibratome.
    1. Tomar la placa de cultivo de 6 cm que contiene el bloque de 20% de gelatina de la nevera. Con un bisturí, cortar un bloque de 5 cm x 5 cm. Pegar la parte superior del bloque para el apoyo con pegamento de cianoacrilato o su equivalente.
    2. Colocar una nueva hoja en el vibratome.
    3. Ajuste el nivel del bloque hasta que quede al mismo nivel de la hoja de afeitar.
    4. Llene la bañera alrededor de la ayuda con fresca CO2-medio independiente a 4 ° C. Cortar el bloque con el vibratome con una velocidad media hasta que el bloque se corta uniformemente, hacia una superficie lisa. Establecer la posición 0.
    5. Aspire el medio alrededor del bloque de gelatina hasta que esté completamente seca y luego tomar la placa de cultivo de 12 pocillos que contienen los tejidos de la incubadora a 37 ° C.
    6. Con fórceps, abra cuidadosamente el inserto de la cultura en la parte superior del bloque de gelatina. Cortar con las tijeras, todas las partes de las membranas que no contiene células (fuera del ring donde no fueron cultivadas células). Aspire el medio residual todo.
    7. Añadir 1 mL de la solución líquida de gelatina de 8% a 37 ° C para cubrir las membranas. Retire con cuidado el exceso. Espere 5-8 min para permitir que la gelatina se solidifique.
    8. Añadir fresco CO2-medio independiente (a 4 ° C) al baño hasta que la membrana está cubierta.
    9. Corte, con el vibratome en una posición de-100 μm, con una velocidad media, permaneciendo consciente de cómo se comporta el bloque. Al final de la sección, tenga cuidado de mantener la orientación del tejido.
    10. Con un bisturí, cortar una esquina para identificar la orientación de la sección.
    11. Recoger la membrana incrustada en gelatina con una espátula y colocar en una placa de 6 pozos llenada con el medio de conservación a 4 ° C, hasta el injerto en el ojo receptor.
    12. A la hora de los trasplantes, ajustar el tamaño del implante que el tamaño del ojo receptor bajo un microscopio quirúrgico (1-3 para las ratas, 10 – 15 mm2 para primates no humanos).

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Resultados

Jamones contienen una capa epitelial que debe retirarse antes de la siembra de las células RPE. Un tratamiento enzimático de la membrana se realiza con el thermolysin bajo agitación. En orden no para no perder la polaridad de la membrana (el epitelio está en un lado), se fija en un soporte que composición puede ser diferente según el proveedor (figura 1A). Comprobar la adherencia de la membrana para su apoyo en este paso y añadir clips si es necesario. En el ...

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Discusión

Hemos descrito un método para el cultivo de células RPE sobre un andamio biológico y su preparación para su implantación en modelos animales. Uno de los pasos críticos del protocolo es el mantenimiento de la orientación de la pieza a lo largo del procedimiento hasta su inclusión en gelatina. De hecho, se elimina el epitelio nativo de la membrana y su membrana basal se convierte expuestos9. Las células RPE deban ser sembrado en la cima de esta membrana del sótano. En preparación para incrustación d...

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Divulgaciones

Olivier Goureau es el inventor en espera de patentes relacionadas con la generación de células de la retina de células madre pluripotentes humanas. Otros autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Jérôme Larghero y Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, París, Francia) por su aporte durante la puesta en marcha del método descrito aquí.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], la Fundación pour la Recherche Médicale [programa de Bio-ingeniería - DBS20140930777] y de la empresa LABEX revivir [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau y Christelle Monville. Fue apoyado por NeurATRIS, una infraestructura de investigación traslacional (Investissements Avenir) para bioterapias en Neurociencias [ANR-11-INBS-0011] y INGESTEM, la infraestructura nacional (Investissements Avenir) Ingeniería pluripotentes y diferenciadas las células madre [ANR-11-INBS-000] Christelle Monville. Karim Ben M'Barek fue apoyado por becas de DIM Stempole y la empresa LABEX revivir [ANR-10-LABX-73]. Madre es parte del Instituto de bioterapias para enfermedades raras, apoyados por la Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cabina de bioseguridad estérilTechGen InternationalNo aplicable
Sistema de eliminación de residuos líquidos para aspiraciónVacuubrandBVC 21
CO2 controlado +37  ° incubadora de celdas CThermo Electron CorporationBVC 21 NT
200  y micro; Pipeta L: P200GilsonF144565
1  mL pipeta: P1000Gilson F144566
Ayuda para pipetearDrummond75001
+4  ° C FrigoríficoLiebherrNo aplicable
VibratomeLeicaVT1000S
Tijeras finasWPI
(x2)WPI555227F
Baño de aguaGrant subaqua proSUB6
Balanza de precisiónCentrífuga
Microscopio Eppendorff5804
OlympusSC30
Agitador basculante horizontalIKA-WERKEIKA MTS 214D
VortexVWRLAB DANCER S40
Bisturí desechableWPI500351
película de parafina plásticaVWRPM992
0.200 µ m filtro de jeringa de un solo usoSARTORIUS16532
Jeringa sin aguja 50 mLDutscher50012
Frascos 250 mLDutscher28024
15 mL tubos Falcon estérilesDutscher352097
50 mL tubos Falcon estérilesDutscher352098
ScaffdexC00001N
60  mm Placas de cultivo celular B6Dutscher353004
placa de cultivo celular de 12 pocillosCorning3512
Placas de cultivo de 6 pocillosCorning3506
Hojas de afeitarTed Pella, Inc121-9
Pegamento de cianoacrilatoCastorama 3178040670105
PBS 1x (500  mL)SigmaD8537
ThermolysineRoche5339880001
DMEM, alto contenido de glucosa, GlutaMAXInvitrogen61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)Invitrogen12618-013
MEM-NEAA (100x)Invitrogen11140-035
b-mercaptoetanol (50  mM)Invitrogen31350-010
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen15140122
medio independiente de CO2GIBCO18045-054
GelatinaMERCK104078
membrana amniótica humanaBanco de tejidos Hospital de San Luis (París, Francia)No aplicable
Pinzas de 501758 Sartorius CP225D Inserto de cultivo

Referencias

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