Medición de la concentración de iones en la capa de límite marchara con pipeta abierta de Patch-Clamp: implicaciones en el Control de los canales iónicos por líquido fluyen

Resumen

Canales del ion Mechanosensitive se estudian a menudo en términos de sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo fluido con grabación de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados de flujo de fluido-regulaciones de los canales iónicos pueden ser erróneo. Aquí, ofrecemos métodos para prevenir y corregir estos errores con una base teórica.

Resumen

Flujo de fluidos es un importante estímulo ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos, como la vasodilatación inducida por el flujo de fluido. Aunque no se entienden totalmente los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas para flujo líquido/fuerza, fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente. Por lo tanto, sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo líquido de los canales iónicos ha sido estudiada mediante la técnica de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados y la interpretación de los datos pueden ser erróneas. Aquí, presentamos la evidencia experimental y teórica para errores relacionados con el flujo de líquido y proporciona métodos para estimar, prevenir y corregir estos errores. Cambios en Unión potencial entre el electrodo de referencia Ag/AgCl y el fluido del baño fueron medidos con una pipeta abierta llenada de 3 M KCl. flujo de fluidos podría entonces cambiar el metal líquido cruce potencial de aproximadamente 7 mV. Por el contrario, midiendo el cambio de voltaje inducido por el flujo de fluidos, se estimó la concentración de iones en la capa de límite inviolables. En la condición estática, las concentraciones de iones real junto a la Ag/AgCl referencia electrodo o ion canal entrada en la superficie de la membrana de la célula pueden llegar a tan bajos como 30% de en la condición de flujo. Colocando una agarosa 3 M puente KCl entre el electrodo de referencia y líquido de baño puede haber evitado este problema de desplazamiento potencial de cruce. Sin embargo, el efecto de marchara capa adyacente a la superficie de la membrana de la célula no podría fijarse de este modo. Presentamos un método para medir las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara con una pipeta abierta abrazadera del remiendo, haciendo hincapié en la importancia de utilizar un puente de sal de agarosa mientras estudiaba regulación inducida por el flujo de fluido de las corrientes de ion. Por lo tanto, este nuevo enfoque, que tenga en cuenta las concentraciones reales de iones en la capa de límite inviolables, puede proporcionar la penetración útil en el diseño experimental y la interpretación de los datos relacionados con la regulación de la tensión de esquileo líquido de los canales iónicos .

Introducción

Flujo de fluidos es una importante señal ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos como la vasodilatación inducida por el flujo de líquido y fluido cortante fuerza dependiente vascular remodelación y desarrollo^{1,2, 3,4,5}. Aunque los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas a fuerza de esquileo del flujo de fluidos no se entienden completamente, se cree que fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente a respuestas inducidas por el....

Protocolo

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices institucionales de la Universidad Konkuk.

1. agarosa sal puentes entre la solución del baño y electrodo de referencia Ag/AgCl

Nota: Agarosa 3M KCl puentes de sal se producen como se ha descrito¹² con variaciones de menor importancia.

1. Formación de puentes
   1. Doblar los tubos capilares de vidrio fuego para formar una forma de U según el caso. El diámetro interior de los capilares debe ser lo bastante grande como para reducir la resistencia durante la grabación de las corrientes de iones grandes. Tubos con un di....

Resultados

Todo celular dependientes de voltaje tipo L de Ca^{2 +} canal (VDCC_L) corrientes se registraron en los miocitos arterial mesentérico de rata enzimáticamente dispersos, como se describió anteriormente¹¹. Los miocitos arteriales se dializaron con una solución de pipeta Cs-ricos en la configuración de perforado de nistatina con solución de baño libre de cationes divalentes para facilitar el flujo de corriente a través de VDCC_L

Discusión

En este estudio, hemos demostrado un método para medir la real concentración de Cl^– en la marchara capa adyacente al electrodo de referencia Ag/AgCl determinando el potencial cruce de metal líquido con una pipeta abierta abrazadera del remiendo con un alta KCl concentración. El cambio en la concentración de Cl^– en la capa límite puede resultar en un cambio de potencial de salida cuando se cambia de estática a las condiciones de flujo de fluido. Simplemente usando una agarosa puente KCl entre el elec.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RC-11 cámara de baño abierta	Warner instruments, EE. UU.	W4 64-0307
Pellet de electrodo de Ag/AgCl	World Precision Instruments, EE. UU.	EP1
Agarosa	Sigma-aldrich, EE. UU.	A9793
Amplificador de pinza de voltaje	HEKA, Alemania	EPC8
Amplificador de pinza de voltaje	Molecular Devices, EE. UU.	Axopatch 200B
Bomba de líquido	KNF Flodos, Suiza	FEM08