Summary
Canales del ion Mechanosensitive se estudian a menudo en términos de sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo fluido con grabación de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados de flujo de fluido-regulaciones de los canales iónicos pueden ser erróneo. Aquí, ofrecemos métodos para prevenir y corregir estos errores con una base teórica.
Abstract
Flujo de fluidos es un importante estímulo ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos, como la vasodilatación inducida por el flujo de fluido. Aunque no se entienden totalmente los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas para flujo líquido/fuerza, fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente. Por lo tanto, sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo líquido de los canales iónicos ha sido estudiada mediante la técnica de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados y la interpretación de los datos pueden ser erróneas. Aquí, presentamos la evidencia experimental y teórica para errores relacionados con el flujo de líquido y proporciona métodos para estimar, prevenir y corregir estos errores. Cambios en Unión potencial entre el electrodo de referencia Ag/AgCl y el fluido del baño fueron medidos con una pipeta abierta llenada de 3 M KCl. flujo de fluidos podría entonces cambiar el metal líquido cruce potencial de aproximadamente 7 mV. Por el contrario, midiendo el cambio de voltaje inducido por el flujo de fluidos, se estimó la concentración de iones en la capa de límite inviolables. En la condición estática, las concentraciones de iones real junto a la Ag/AgCl referencia electrodo o ion canal entrada en la superficie de la membrana de la célula pueden llegar a tan bajos como 30% de en la condición de flujo. Colocando una agarosa 3 M puente KCl entre el electrodo de referencia y líquido de baño puede haber evitado este problema de desplazamiento potencial de cruce. Sin embargo, el efecto de marchara capa adyacente a la superficie de la membrana de la célula no podría fijarse de este modo. Presentamos un método para medir las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara con una pipeta abierta abrazadera del remiendo, haciendo hincapié en la importancia de utilizar un puente de sal de agarosa mientras estudiaba regulación inducida por el flujo de fluido de las corrientes de ion. Por lo tanto, este nuevo enfoque, que tenga en cuenta las concentraciones reales de iones en la capa de límite inviolables, puede proporcionar la penetración útil en el diseño experimental y la interpretación de los datos relacionados con la regulación de la tensión de esquileo líquido de los canales iónicos .
Introduction
Flujo de fluidos es una importante señal ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos como la vasodilatación inducida por el flujo de líquido y fluido cortante fuerza dependiente vascular remodelación y desarrollo1,2, 3,4,5. Aunque los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas a fuerza de esquileo del flujo de fluidos no se entienden completamente, se cree que fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente a respuestas inducidas por el flujo de fluidos5 , 6 , 7 , 8. por ejemplo, activación del rectificador endotelial interno Kir2.1 y Ca2 +-K activada+ (KCa2.3, KCNN3) canales después de Ca2 + afluencia de flujo de fluidos se ha sugerido para contribuir a líquido vasodilatación inducida por el flujo6,7,8. Por lo tanto, muchos canales del ion, especialmente activado mecánicamente o - inhibición canales, han sido estudiadas en términos de flujo fluido/seguridad sensibilidad a la fuerza con la técnica de patch-clamp6,9,10 , 11. sin embargo, dependiendo del protocolo experimental realizado durante la grabación-abrazadera del remiendo, los resultados y la interpretación de los datos de flujo líquidos-regulaciones de los canales iónicos pueden ser erróneas10,11.
Una fuente de artefactos inducidos por el flujo de fluido en grabación de patch-clamp es de la Unión potencial entre el baño líquido y de electrodo de referencia Ag/AgCl11. Se cree generalmente que la ensambladura del metal líquido potencial entre el baño líquido y el electrodo de Ag/AgCl es constante la concentración de Cl– del líquido del baño se mantenga constante, teniendo en cuenta la respuesta química entre la solución del baño y el electrodo de Ag/AgCl que:
AG + Cl–↔ AgCl + electrón (e–) (ecuación 1)
Sin embargo, en un caso donde la reacción electroquímica general entre la solución de baño y electrodo de referencia Ag/AgCl (ecuación 1) se procede de izquierda a derecha, la concentración de Cl– del baño líquido adyacente a Ag/AgCl de referencia electrodo (capa límite marchara12,13,14,15) puede ser mucho menor que en la mayor parte del baño de solución, a menos que suficiente transporte convencionales está garantizada. Utilizando un electrodo de Ag/AgCl viejo o no ideales con cloración inadecuada de Ag puede aumentar ese riesgo. Este artefacto relacionados con el flujo de fluido en el electrodo de referencia, de hecho, puede ser excluido, simplemente colocando un puente convencional de agarosa-sal entre el baño líquido y referencia electrodo, ya que el artefacto se basa en alteraciones en Cl verdadero– concentración junto a la del electrodo de Ag/AgCl11. El protocolo presentado en este estudio describe cómo prevenir los cambios potenciales relacionadas con el flujo de salida y medir las concentraciones de iones real en la capa de límite inviolables.
Después de colocar una agarosa puente KCl entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl, hay otro factor fundamental que debe considerar: solo como referencia de Ag/AgCl actúa como un electrodo Cl– , los canales iónicos también pueden funcionar como un electrodo selectivo de iones. La situación de una capa límite inviolables entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl se presenta durante el movimiento de iones entre las soluciones a través de los canales iónicos de la membrana extracelulares e intracelulares. Esto implica que debe tener precaución al interpretar la regulación de iones canales de flujo de fluidos. Como comentamos en nuestro anterior estudio11, el movimiento de iones a través de una solución en la que existe un gradiente electroquímico puede ocurrir por tres mecanismos distintos: difusión, migración y convección, donde la difusión es el movimiento inducida por el gradiente de concentración, la migración es el movimiento impulsado por el gradiente eléctrico y la convección es el movimiento a través de flujo de líquido. Entre estos mecanismos de tres transporte, el modo de convección contribuye más al movimiento de iones11 (> 1.000 veces mayor que la difusión o la migración en la configuración habitual de abrazadera del remiendo). Esto forma la base teórica de por qué conexiones posibles entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl pueden muy bajo diferentes condiciones estática y el flujo de fluido11.
Según la hipótesis propuesta anteriormente, algunos efectos facilitatory del flujo de fluidos en el canal de ion actual pueden inferirse de la restauración convectiva de las concentraciones de iones real junto a la entrada del canal en la superficie de la membrana (capa de límite inviolables) 10. en este caso, los efectos inducidos por el flujo fluidos en corrientes del canal de iones simplemente han surgido de eventos electroquímicos, no de la regulación de la compuerta de canal de iones. Una idea similar fue sugerida previamente por Barry y colaboradores12,13,14,15 basado en rigurosas consideraciones teóricas y la evidencia experimental, también conocida como la capa inviolables o efecto del número de transporte. Si algunos canales iónicos tienen suficiente solo canal conductancia y suficientemente largo tiempo abierto para proporcionar suficiente transporte precios a través de los canales (una más rápida tasa de transporte en la membrana que en la superficie de la membrana inviolables), un efecto de capa límite pueden surgir . El transporte dependiente de la convección puede contribuir a las eventual facilitaciones inducida por el flujo de líquido de ion actual10,12,13,14,15.
En este estudio, destacamos la importancia de la utilización de agar o agarosa al puente de sal mientras estudiaba regulación inducida por el flujo de fluido de las corrientes de iones. También proporcionamos un método para medir las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara junto a los Ag/AgCl referencia electrodos y membranas canales de iones. Además, la interpretación teórica de fluido modulación inducida por el flujo de corrientes de canal de iones (es decir, convección hipótesis o efecto número de capa marchara transporte) puede proporcionar información valiosa para diseñar e interpretar estudios sobre cortante fuerza-regulación de canales iónicos. Según el efecto de número de transporte de capa límite inviolables, predecimos que corrientes de canal de iones a través de todos los tipos de canales iónicos de membrana pueden facilitarse por el flujo de líquido, independientemente de su sensibilidad biológica a la fuerza de esquileo del flujo de fluidos, pero sólo si los canales iónicos tienen conductancia suficiente de canal único y tiempo abierto. Mayores densidades de corriente de canal de ion puede aumentar el efecto de la capa límite marchara en la superficie de la membrana de la célula.
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Protocol
Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices institucionales de la Universidad Konkuk.
1. agarosa sal puentes entre la solución del baño y electrodo de referencia Ag/AgCl
Nota: Agarosa 3M KCl puentes de sal se producen como se ha descrito12 con variaciones de menor importancia.
- Formación de puentes
- Doblar los tubos capilares de vidrio fuego para formar una forma de U según el caso. El diámetro interior de los capilares debe ser lo bastante grande como para reducir la resistencia durante la grabación de las corrientes de iones grandes. Tubos con un diámetro interno de 2-5 mm son generalmente aceptables.
- Preparación de solución de agarosa de 3 M KCl
- Preparar 100 mL de solución de KCl de 3 M (1 M o 2 M también es aceptable).
- Pesar 3 g de agarosa.
- Disolver la agarosa en 100 mL de KCl (es decir, 3% de agarosa) sobre una placa caliente entre 90 y 100 ° C.
- Carga de los puentes con agarosa de KCl de 3 M
- Para facilitar la carga, sumerja los puentes de cristal en forma de U en la solución de agarosa-KCl.
Nota: Es fácil de cavar hacia fuera los puentes de cristal si la solución de agarosa-KCl está contenida en un recipiente poco profundo y amplio. - Mantenerlos durante la noche a temperatura ambiente (RT) para la agarosa y endurecen.
- Con cuidado sacar los puentes de cristal agarosa-KCl-cargado de la agarosa-sal conjunto/endurecido.
- Para facilitar la carga, sumerja los puentes de cristal en forma de U en la solución de agarosa-KCl.
- Almacenamiento de los puentes
- Prepare suficiente volumen (es decir, 500 mL) de la solución de KCl de 3 M en una botella de cuello ancho.
- Guarde los puentes de agarosa-sal preparados en la botella en el refrigerador.
2. aplicación de la fuerza de esquileo del flujo de fluidos a las células en una cámara de sujeción parche
Nota: En la figura 1se muestra un diagrama esquemático del montaje experimental de patch-clamp.
- Lugar un contenedor cargado con solución de baño (volumen y altura deben ser medidos ya) por encima de la cámara de patch-clamp.
- Llene la cámara de la abrazadera del remiendo con la solución de baño por aspiración del tubo.
- Para detener el flujo de fluidos, clip del tubo en el lado del contenedor para bloquear el flujo de fluidos y, a continuación, enganche el tubo en el lado de aspiración para detener la succión al mismo tiempo. Esta es la condición de control "fijos".
- Para aplicar fuerza de esquileo del flujo de fluidos, Abra ambos tubos a los lados del contenedor y la succión al mismo tiempo.
- Antes o después de aplicar la fuerza de esquileo del flujo de fluidos a la celda, medir el caudal en mL/min.
- Calcular el caudal midiendo la disminución en el volumen de líquido en un momento dado.
- Del caudal medido y geometría (estructura) de la cámara del baño, debe estimarse la fuerza de corte aplicada a la celda por el flujo de fluidos (véase la sección discusión).
- Alternativamente, para controlar el caudal (para pasos 2.3-2.6), utilizar una bomba de perfusión. En este caso, tenga cuidado asegurar una constante en lugar de un flujo pulsátil.
3. medición de cambios en el potencial de la ensambladura del Metal líquido por flujo de fluidos entre la solución del baño y electrodo de referencia Ag/AgCl (Figura 3A)
- Utilizar el electrodo de Ag/AgCl o pellets, que está disponible en los productos confeccionados, sin el puente de sal de agarosa.
- Preparación de solución salina fisiológica de una sal normal para la sala de baño (p. ej., 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucosa, pH ajustado a 7,4 con NaOH).
- Coloque una pipeta de parche que contiene una solución de KCl de 3 M en la cámara para minimizar el cambio de potencial de unión entre la pipeta y soluciones de baño.
- Fijar el amplificador de voltaje-abrazadera para el modo actual de la abrazadera ("I = 0" o "CC").
- Después de anular el potencial desplazamiento inicial, medir los cambios en el voltaje inducido por diferentes caudales.
- Para verificar que los cambios en el voltaje son potenciales de unión de metal líquido, vuelva a examinar el efecto del flujo sobre el potencial de cruce con el puente de sal de agarosa entre la solución del baño y electrodo Ag/AgCl.
4. experimental estimación de la concentración de Cl verdadero– en la marchara capa adyacente al electrodo de Ag/AgCl bajo condición estática (figura 3B)
- De los resultados del paso 3, dibujar las relaciones de flujo potencial de cruce y estimar el valor máximo (saturación) de potencial cambio de cruce por el caudal de fluido de supra.
- Preparar soluciones con diferentes concentraciones de Cl (es decir, 50, 99, 147, 195 y 288 mM de NaCl).
- Cambiando el Cl– la concentración en el líquido de baño, dibujar la Unión potencial [Cl–] relación. Tenga en cuenta que la tasa de líquido debe ser constante y suficientemente alta (> 30 mL / min) para evitar la disminución de la concentración de Cl– a la del adyacente electrodo de referencia Ag/AgCl.
- De las curvas de relación de dos, estimar los cambios en la concentración de Cl– de la cambio del potencial de cruce medido.
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Representative Results
Todo celular dependientes de voltaje tipo L de Ca2 + canal (VDCCL) corrientes se registraron en los miocitos arterial mesentérico de rata enzimáticamente dispersos, como se describió anteriormente11. Los miocitos arteriales se dializaron con una solución de pipeta Cs-ricos en la configuración de perforado de nistatina con solución de baño libre de cationes divalentes para facilitar el flujo de corriente a través de VDCCL11,16. Breve despolarización tensión rampas o pasos de voltaje, en un potencial de explotación de -70 mV, se aplicó para obtener las corrientes VDCCL . Un representante corriente-voltaje (-V) relación de VDCCL en la ausencia y presencia de fluido (5 mL/min o aproximadamente 0.004 m/s), grabado con una agarosa puente de KCl, se muestra en la figura 2A. Flujo había aumentado levemente el VDCCL actual de manera independiente de la tensión. Este efecto facilitador de flujo de fluidos en el VDCCL actual se resume en la figura 2B.
La facilitación de la independiente de la tensión de VDCCL actual de flujo de fluidos es una respuesta adecuada de la VDCCL a la fuerza de líquido o de cizalla. 5 mL/min o aproximadamente 0.004 m/s de fluido en la instalación experimental actual se estima que representan aproximadamente 0,1 dyn/cm2 en términos de esfuerzo cortante (véase discusión). Sin embargo, cuando el Ag/AgCl de referencia electrodo estaba directamente relacionado con el fluido del baño sin una agarosa puente de KCl, la relación de V - de la en presencia de fluido que se desplaza hacia la derecha en comparación con las corrientes VDCCL bajo una estática condición (figura 2 y 2D). Esto dio lugar a la inhibición de VDCCL corriente a voltajes negativos y facilitación de VDCCL corriente más despolarizados o positivos potenciales. Esto ejemplifica el artefacto inducida por el flujo de fluidos en la grabación de patch-clamp en la que un cambio de tensión de la relación de V - no era debido a la modificación de gating del canal pero era en realidad debido a un cambio potencial de la ensambladura entre el baño líquido y Ag/AgCl referencia de electrodo11. Evidencia directa para el cambio de potencial de cruce inducida por el flujo de líquido se muestra en la figura 3.
Se midieron los cambios de potencial de Unión según el paso 3. Los cambios, debido al flujo de fluidos, fueron medidos con una pipeta abierta llenada de 3 M KCl, como se describió anteriormente11. Con una pipeta abierta llenada de 3 M KCl, podría reducirse al mínimo la Unión potencial entre la pipeta y soluciones de baño, y los posibles cambios debido al flujo de fluidos eran principalmente de la solución de baño y electrodo de referencia Ag/AgCl. Sin una agarosa 3 M KCl puente entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl, fluido cambió de puesto la Unión potencial entre el líquido y el electrodo de Ag/AgCl en una manera dependiente de la tasa de fluido (Figura 3A). El cambio de potencial de Unión máxima fue extrapolado para ser ~ 7 mV de la relación de flujo de fluido potencial de cruce (Figura 3A, parte inferior). Por el contrario, cuando la agarosa 3 M KCl puente fue utilizado, flujo de fluidos no alteró la Unión potencial entre el electrodo de referencia y fluido de baño (resumidos en el gráfico de la parte inferior de la Figura 3A, abajo).
Para medir las diferencias de concentración entre las condiciones de flujo de fluidos y estática, en que suficiente convección modos de acción son funcionales, examinamos el efecto de cambiar las concentraciones de Cl– en el baño líquido-Ag/AgCl electrodo conexiones potenciales según el paso 4. Aumento de la concentración de Cl– cambiado de puesto la Unión posible de una manera dependiente de la concentración (figura 3B, top) como fluido cambió de puesto el potencial de una manera dependiente de la tasa de cruce. Usando un puente de agarosa de KCl, el potencial de Unión se le impidió cambiar en una Cl– manera dependiente de la concentración (figura 3), que indica que el cambio de potencial de cruce se produjo entre el electrodo de referencia y la solución de baño no entre las soluciones del baño y pipeta. En la parte inferior de la figura 3Bse muestra la trama semi-log de la ensambladura potencial [Cl–] relación. Según los resultados en la figura 3B, el valor extrapolado de la máximo de ~ 7 mV en cruce posible cambio ( Figura 3A) sugiere que la concentración de Cl– adyacente al electrodo de referencia Ag/AgCl disminuye a ~ 70% de la concentración media de la mayor parte baño fluido cuando el flujo de fluido está ausente (figura 3B, parte inferior).
En nuestro estudio anterior, Kir2.1 corrientes reportaron facilitada por flujo convectivo restaurando (creciente) [K+] en la entrada de canal10. Esta idea nace de los fenómenos que ocurren entre el baño líquido y el electrodo de Ag/AgCl, el canal Kir2.1 puede funcionar como un electrodo K+ así como las funciones de electrodo de Ag/AgCl como un electrodo Cl– . Esta idea se ilustra esquemáticamente en la Figura 4A y 4B. Un ejemplo representativo de facilitación inducida por el flujo líquido de Kir2.1 corrientes se muestra en la figura 4. Las corrientes de Kir2.1 fueron sacadas por un paso de tensión hiperpolarizador de un potencial de explotación de 0 a -100 mV en las células de la leucemia basophilic (RBL) de rata. Aplicación de flujo de fluidos (5 mL/min o 0.004 m/s) había aumentado fácilmente la corriente de Kir2.1 (figura 4). Esta facilitación por fluido previamente sugirió a estar mediada no por señalización celular sino por el efecto electroquímico del transporte convectivo de los iones de K+ a la capa de límite marchara10.
Figura 1: esquema que muestra la configuración de la cámara de baño para la regulación del caudal de fluido de los canales iónicos en la grabación de patch-clamp. Panel inferior es la vista lateral (sección sagital) de la cámara de patch-clamp. Resume la trayectoria de flujo de fluidos y localizaciones de una célula estudiada, electrodos y entrada y salida del fluido. Porque el líquido se bombea continuamente a través del tubo de salida de succión, la altura de líquido en la cámara se mantiene a un nivel relativamente constante. Esta figura ha sido modificada de una anterior publicación11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efectos del líquido fluyen en tipo L voltaje dependientes Ca2 + canal (VDCCL) corrientes con y sin la agarosa 3 M puente de KCl. VDCCL corrientes se registraron en los miocitos arterial mesentérica de rata enzimáticamente dispersos con grabación perforada abrazadera del remiendo de nistatina. Tyrode normal solución salina fisiológica con 4,2 mM EDTA sin cationes divalentes fue utilizada como la solución de baño11. La solución de pipeta contenía CsCl, 140 m m; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 mM; EGTA 0,05 mM; ajustó el pH a 7.2 con CsOH. (A y B) Con agarosa 3M KCl-puente. (A) una representante -V relación de la corriente VDCCL y los efectos de flujo de fluidos. (B) Resumen de los efectos líquidos sobre la -V relación VDCCL corrientes. (C y D) Sin agarosa 3M KCl puente. (C) -V las relaciones de las corrientes VDCCL . (D) Resumen -V las relaciones de las corrientes de pico VDCCL en la ausencia y presencia de flujo de fluidos. En el recuadro de la figura se muestran las formas de los pasos de voltaje para suscitar VDCCL corrientes. Esta figura ha sido modificada de una anterior publicación11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos del flujo de fluidos en metal líquido conexiones posibles entre el baño líquido y Ag/AgCl de referencia electrodo y estimación de la concentración de Cl– real en la marchara capa adyacente al electrodo de referencia de la Unión medida potencial. (A) seguimiento representativo A cambios potenciales de unión debido a diferentes tasas de flujo de fluidos (panel superior). Esta figura ha sido modificada de una anterior publicación11. La relación de tasa de flujo fluido potencial cruce (n = 5). (B) superior panel: Representante grabación de potenciales cambios de cruce debido a diferentes concentraciones de las soluciones de NaCl. Panel inferior: la trama semi-log de la ensambladura potencial [Cl–] relación (n = 5). La recta en rojo representa la mejor opción por una modificado ecuación de Nernst para el equilibrio potencial con una pendiente de diez veces de 49 mV. Debido a la selectividad finita de Na+, en comparación con el de Cl-, para la generación de la ensambladura del metal líquido potencial, el valor de la pendiente de 49 mV, en lugar de 58 mV, produjo el mejor ajuste en la relación de Unión potencial-[Cl–] en la sala de temperatura. La cuesta de 49 mV indica que la Cl– dependencia o selectividad de referencia Ag/AgCl electrodo > 95% sobre la de otros iones (en este caso, Na+), según la ecuación del voltaje de Goldman-Hodgkin-Katz. Un cambio de 7 mV con una concentración de Cl– de 150 mM indica una disminución del 30% en la concentración de Cl– . Seguimiento representante (C) un potencial de Unión en diferentes concentraciones de las soluciones de NaCl con un uso de puente de agarosa M KCl 3 (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: esquema de los efectos del modelo de convección del fluido en las concentraciones de iones adyacentes a los canales abiertos durante flujo actual ion. (A) en condiciones estáticas con poco transporte convectivo de iones en la solución con el campo eléctrico, el ion K+ de flujo a través de K+-canales iónicos selectivos pueden provocar una disminución en las concentraciones de K+ en el microdomain adyacente a la entrada de canal. (B) flujo convectivo puede restaurar la disminución en la concentración de K+ adyacente a la entrada de canal abierto. (C) efecto de flujo de fluidos en las corrientes de canal Kir2.1 rectificador hacia adentro. Fluido aumenta al instante las corrientes Kir2.1. En el recuadro de la figura se muestra la forma del paso de voltaje. Las corrientes de Kir2.1 se registraron con alto K+-baño - pipeta soluciones. Solución de baño: 148,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucosa; ajustó el pH a 7,4 con NaOH. Pipetear la solución: 135 mM KCl, 5 mM NaCl, Mg-ATP, 10 mM HEPES, de 5 mM 5 mM etilenglicol-bis (2-aminoetil)-N, N, N', N',-ácido tetraacético (EGTA), pH 7.2 (ajustado con KOH). Puesto que las células RBL - 2H 3 son altamente susceptibles a los inflamación hypo-osmótica y consiguiente disparador de volumen activado Cl– corrientes, 38 mM sacarosa fue agregado a la solución de baño para ajustar para la osmolaridad y prevenir la hinchazón de la célula. Por otra parte, un bloqueador de canales de Cl– [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic ácido (DIDS, 30 μm)] fue agregado a la solución de la pipeta para eliminar cualquier contaminación por corrientes de Cl– . Panel C ha sido modificado de una anterior publicación10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, hemos demostrado un método para medir la real concentración de Cl– en la marchara capa adyacente al electrodo de referencia Ag/AgCl determinando el potencial cruce de metal líquido con una pipeta abierta abrazadera del remiendo con un alta KCl concentración. El cambio en la concentración de Cl– en la capa límite puede resultar en un cambio de potencial de salida cuando se cambia de estática a las condiciones de flujo de fluido. Simplemente usando una agarosa puente KCl entre el electrodo de referencia y el fluido del baño puede evitar que los errores relacionados con la concentración de Cl– o artefactos durante la grabación de la abrazadera del remiendo.
Además haciendo hincapié en la importancia de un puente de sal agar o agarosa, otra aplicación de este método en la estimación de la concentración real de iones en la capa de límite marchara es la siguiente. Porque canales iónicos plasmalemmal pueden funcionar como electrodos ion-selectivos (como el Ag/AgCl electrodo funciona como un electrodo Cl– ), la concentración real de iones en los límites inviolables de la capa adyacente a la entrada del canal en la membrana celular superficie puede ser diferente de la concentración media del líquido a granel. Esta diferencia en la concentración de iones entre la mayor parte líquida y marchara la capa adyacente a la membrana de la célula es el escenario real en contextos clínicos y debe ser distinguida de la modulación biológica del canal compuerta de flujo fluido/fuerza. Lamentablemente, a diferencia del efecto de capa inviolables entre el electrodo de referencia Ag/AgCl y el fluido del baño, no podemos fijamos el efecto marchara capa adyacente a la superficie de la membrana de la célula al estudiar la regulación de canales iónicos por flujo fluido/fuerza.
Sin embargo, teniendo en cuenta la observación de que la concentración de iones real en la capa marchara es aproximadamente el 70% de en el líquido a granel (figura 3), podemos hacer algunas modificaciones en los datos experimentales para distinguir la modulación biológica de los canales iónicos desde el "fenómeno electroquímico de efecto de capa marchara". La concentración real de iones en la capa marchara en la superficie de la membrana de la célula se espera que aproximadamente el 70% de la concentración promedio de la masa de solución en un reciente estudio10de baño. Desde flujo había restaurado la concentración del ion disminuida, facilitó la actual independientemente de celular señalización10Kir2.1. En nuestro estudio anterior, densidad de corriente era considerablemente alta (2,5 A / m2) con+ K extracelular alta concentración y alta expresión de Kir2.1 en RBL células10. Sin embargo, en el caso de las membranas celulares reales con diferentes amplitudes de densidad de corriente de canal iónico, el efecto de capa marchara en la superficie de la membrana de la célula puede dependen en gran medida la amplitud de la densidad de corriente de canal de iones. Además, puede ocasionar algunos iones corrientes de canal (especialmente aquellos con relativamente bajas densidades de corriente) al ser insensible a la regulación del caudal de fluido; Aunque el efecto de capa marchara es regulado electroquímicamente y no biológico. Por lo tanto, esto puede afectar a la técnica descrita aquí. Por lo tanto, la posibilidad de desarrollar un método cuantitativo que es adecuado para corregir los resultados experimentales debe ser investigados en el futuro estudios.
En la figura 3, observamos que cruce de metal líquido potencial entre el electrodo de referencia Ag/AgCl y baño líquido era mucho depende de la condición del electrodo Ag/AgCl. De hecho, cuando el electrodo de Ag/AgCl era perfecto en condiciones, cambios de conexiones potenciales debido al flujo de fluidos fue mínima (datos no mostrados). Sin embargo, deficiente cloración del electrodo Ag/AgCl causó un cambio mayor en la ensambladura del potencial. Puesto que el electrodo de referencia Ag/AgCl es muy susceptible a diversos estímulos externos, como el estrés oxidativo y luz ultravioleta, siempre es recomendable la utilización de agar o agarosa puente de KCl. Aunque cambios en el potencial de la ensambladura por líquido fluyen entre baño líquido y el electrodo de referencia es una fuente potencial de error, estimamos correctamente las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara midiendo el cambio de cruce potencial bajo diversas tasas de flujo de líquido (Figura 3A y 3B).
El punto crítico en el paso 4 para preparar la curva estándar para la estimación de la concentración de Cl– real en las capas límites inviolables de la cambio del potencial de Unión es que la curva estándar se debe registrar bajo un caudal suficiente (30 mL / minuto en este experimento). Aunque este flujo es muy rápido, en casos prácticos el más rápidos el líquido, la menor caída de la concentración es en las capas límite (figura 3). Además, llenar la pipeta abierta con KCl alta, en lugar de una solución de pipeta regulares, en orden para un estudio de patch-clamp evitar el cambio de conexiones posibles entre una pipeta y la solución de baño.
La fuerza de esquileo en el ajuste de la abrazadera del remiendo puede estimarse de la siguiente relación11:
Τ = (6μQ) / (bh2) (ecuación 2)
Donde: τ es la tensión de cizalladura (N/cm2); Μ es la viscosidad (0.001 N m/s2 para agua a 20 ° C); Q es el caudal de fluido (m3/s); b es el ancho de la cámara (m); y h es la altura de la cámara (m). Cuando el caudal de fluido 30 mL/min, la fuerza de esquileo en la cámara de revisión que se muestra en la figura 1 se estima ~0.75 dyn/cm2 según la ecuación anterior. Este es un nivel de fuerza de esquileo baja comparado con la fuerza de corte fisiológico; las células endoteliales en los vasos sanguíneos pueden ser sometidas a las fuerzas de hasta 40 dyn/cm18,19de cizalla. Por lo tanto, siempre que los canales iónicos no son sensibles a las fuerzas de cizalla menos de 0.75 de dyn/cm2, podemos estudiar la sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo líquido de los canales iónicos después de excluir el efecto de la capa límite marchara estableciendo la condición de control a 0.75 dyn/cm2. Sin embargo, algunos canales iónicos, incluyendo Kir2.1, parecen ser sensibles a las fuerzas de cizalla menos de 0.75 dyn/cm2,3,4,5,6.
El efecto de capa marchara fue sugerido originalmente por Barry y colaboradores12,13,14,15. Aquí, nos proporcionan un método para estimar la concentración de iones real en la capa marchara por la medición de cambios en el potencial de la ensambladura con pipeta abierta patch-clamp. También sugerimos que este efecto de capa límite marchara puede contribuir a fluido regulación inducida por el flujo de las corrientes del canal iónico y debe considerarse mientras estudiaba fluido mechanosensitivity de flujo de los canales iónicos. Sin embargo, partiendo de esta hipótesis, se puede preguntar por qué algunas corrientes del canal de iones no son sensibles a líquidos regulación dependiente del flujo si el efecto de la capa límite marchara es un electroquímico en lugar de control biológico. Como brevemente abordado anteriormente, esto es probablemente porque sólo corrientes de iones a través de los canales con gran suficiente conductancia de un canal y bastante abierto largo puede facilitarse mediante el flujo de fluido. Es decir, para el establecimiento de la capa marchara en la que la concentración de iones es diferente de la media en la solución a granel del flujo en la fase de membrana debe ser bastante rápido comparado con que en el medio acuoso fase14. Recientemente hemos propuesto que la corriente a través de canales de Kir2.1, cuya conductancia y tiempo son lo suficientemente altos, facilita el flujo de fluidos a través de mecanismos de restauración convectivo de la concentración de iones en la capa de límite inviolables de superficie de la membrana de la célula11.
En conclusión, presentamos un método para medir la concentración de iones en la marchara capa límite adyacente a la superficie de electrodos y membrana de la célula de referencia con una pipeta abierta patch-clamp. Además haciendo hincapié en la importancia de una agarosa puente de KCl, este método también proporciona una manera de explicar el efecto de capa inviolables mientras interpretación de control de fuerza de flujo/esquileo líquido de los canales iónicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el programa de centro de investigación pionero (2011-0027921), por programas de básico ciencia investigación (2015R1C1A1A02036887 y NRF-2016R1A2B4014795) a través de la Fundación de investigación nacional de Corea financiado por el Ministerio de ciencia, TIC & Planificación de futuro y por una beca de la Corea salud tecnología R & D Project a través de Corea salud industria desarrollo Institute (KHIDI), financiado por el Ministerio de salud y asistencia social, República de Corea (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
