El objetivo del protocolo es mostrar longitudinal intravital seguimiento en tiempo real de los timocitos por microscopía en implantes tímicos en la cámara anterior del ojo de ratón del laser. La transparencia de la córnea y la vascularización del injerto permiten grabar continuamente reclutamiento de células progenitoras y salida de células T madura.
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Artículo de método
Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real
En este artículo
Resumen
Resumen
El propósito del método presentado es mostrar, por primera vez, el trasplante de thymi recién en la cámara anterior del ojo de ratones adultos isogénicas para en vivo longitudinal seguimiento en tiempo real de la dinámica de thymocytes´ dentro de un vascularizado segmento de timo. Después del trasplante, láser, microscopía (LSM) a través de la córnea permite que en vivo no invasor proyección de imagen repetida a nivel celular de resolución. Lo importante es el enfoque agrega a maduración de células T intravital anterior imagen modelos la posibilidad de reclutamiento de células progenitoras continua y grabaciones de salida de células T maduras en el mismo animal. Ventajas adicionales del sistema son la transparencia de la zona injertada, permitiendo monitoreo rápido macroscópica del tejido implantado, y la accesibilidad al implante que permite localiza además de tratamientos sistémicos. La principal limitación es el volumen del tejido se ajusta en el reducido espacio de la cámara de ojo que exige para el ajuste del lóbulo. Se maximiza la integridad del órgano por disección lóbulos del timo en los patrones previamente demostrados ser funcionales para la producción de células T madura. La técnica es potencialmente adecuada para interrogar a un entorno de médicamente relevantes cuestiones relacionadas con la función del timo que incluyen autoinmunidad, inmunodeficiencia y tolerancia central; procesos que siguen siendo mecánico mal definidos. La disección fina de mecanismos rectores thymocyte migración, diferenciación y selección debe conducir a nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a células T en desarrollo.
Introducción
Diferenciación intratímica de células T y células T subpoblación selección constituyen procesos claves para el desarrollo y mantenimiento de la inmunidad mediada por células en vertebrados1. Este proceso implica una compleja secuencia de eventos firmemente organizados incluyendo el reclutamiento de progenitores de sangre, proliferación celular y migración, expresión diferencial de proteínas de la membrana y muerte celular programada masiva para subconjuntos selección. El resultado es la liberación de células T maduras reactivas a un amplio espectro de antígenos extraños mientras se muestra minimizado las respuestas para auto-péptidos, que final....
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Protocolo
El cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Miami aprobaron todos los experimentos según las pautas IACUC.
1. aislamiento y corte de recién nacido Thymi
- Preparar todos los reactivos y los instrumentos por autoclave u otros métodos, asegurando las condiciones de esterilidad.
- Para minimizar la contaminación, realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo campana de flujo laminar.
- Antes euthanizing ratones donantes, llene un recipiente estéril de 60 mm con 1 prechilled estéril x solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y coloque en hielo. Se utilizará para aclara....
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Resultados
Timo de ratones recién nacidos fueron aislados de B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas ratones como se describe en este protocolo (pasos 1.1-1.9). En estos ratones transgénicos, el promotor de pollo beta actina dirige la expresión de la variante de la proteína fluorescente roja DsRed. MST bajo la influencia de la inmediata temprana potenciador del citomegalovirus (CMV) facilitando el seguimiento de los implantes.
Para pre.......
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Discusión
Debido a la importancia de la maduración de células T para competencia inmune individual4 y el presunto impacto de precursor celular dinámica en células T maduras producidas por el timo2,3, se han invertido grandes esfuerzos desarrollar alternativas al enfoque clásico tejido fijo instantánea.
Aunque claramente superiores en la reproducción de la arquitectura del tejido de monocapas o agregado órgano timo cultura.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH R56DK084321 (CA), R01DK084321 (CA), R01DK111538 (CA), R01DK113093 (CA) y R21ES025673 (CA) y por la concesión del mejor/2015/043 (Consellería de Educació, cultura i esport, Generalitat valenciana, Valencia, España) (EO). Autores agradecen al equipo enviado a la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, España y Alberto Hernández en el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, España por su ayuda con video filmación y edición.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vaporizador de isofluorano con isofluorano | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Visor de disección con fuente de luz | Zeiss | Stemi 305 | |
| Pinzas de disección fina | WPI | 500455 | |
| Pinzas de disección medianas | WPI | 501252 | |
| disección fina de punta curva | WPI | 15917 | |
| Tijeras Vannas | WPI | 503371 | |
| Tijeras de disección | WPI | 503243 | |
| Bisturí | WPI 500353 | ||
| 40 mm Agujas 18G | BD | 304622 | |
| Pipeta de transferencia desechable | Thermofisher | 201C | |
| Almohadilla térmica y lámpara de calor | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Etanol 70% | VWR | 83.813.360 | |
| Plato estéril de 60 mm | SIGMA | CLS430166 | |
| Estéril 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Toallitas estériles | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Medicamentos para el tratamiento del dolor | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Solución salina o Viscotears | Novartis | N/A | |
| Microscopio estereoscópico | Leica | MZ FLIII | |
| Adaptador de sujeción de la cabeza | Narishige | SG-4N-S | |
| Máscara de gas | Narishige | GM-4_S | |
| Microscopio confocal | Leica | TCS SP5 II | |
| Campana de flujo laminar | Telstar | BIO IIA |
Referencias
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006). ....
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Reimpresiones y permisos
