Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para modificar genéticamente las células primarias o ampliadas humano naturales del asesino (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Mediante este protocolo, hemos generado las células NK humanas deficientes para el receptor 2 del factor de crecimiento-b de transformación (TGFBR2) y la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).

Resumen

CRISPR/Cas9 tecnología está acelerando ingeniería del genoma en muchos tipos celulares, pero hasta el momento, genes y modificación genética estable han sido difíciles en primarias células de NK. Por ejemplo, entrega de transgenes mediante transducción retroviral o lentivirales dio lugar a una producción limitada de ingeniería genética de las células NK por sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células. Aquí describimos un método libre de ADN para la edición del genoma de humanos primarias y ampliadas las células NK mediante complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permite eficiente nocaut del TGFBR2 y HPRT1 genes en las células NK. Datos de RT-PCR demostraron una disminución significativa en el nivel de expresión del gen, y un ensayo de citotoxicidad de un producto representativo de la célula sugiere que las células NK modificado de RNP se hizo menos sensibles a TGFβ. Células genéticamente modificadas podrían ser ampliada post-electroporación por estimulación con mbIL21-expresando irradiado células de alimentador.

Introducción

Inmunoterapia de cáncer se ha avanzado en los últimos años. Las células T antígeno quimérico genéticamente del receptor (coche) son un excelente ejemplo de ingeniería células inmunes desplegado en inmunoterapia del cáncer. Estas células fueron recientemente aprobadas por la FDA para el tratamiento contra CD19 + B de células malignas, pero éxito hasta el momento se ha limitado a enfermedades teniendo unos antígenos targetable y dirigidas a tal limitado repertorio antigénico son propensa al fracaso por escape inmune. Además, las células de T del coche se han enfocado en el uso de células de T autólogas debido al riesgo de enfermedad injerto contra – host causado por cél....

Protocolo

Buffy coats de donante sano se obtuvieron como material de la Central Ohio región Cruz Roja Americana. Esta investigación fue determinada para ser exento Investigación Hospital institucional Informe Junta de todo el país de los niños.

1. expansión y purificación de células NK humano

1. Aislante PBMCs de la capa anteada¹².
   1. Capa de 35 mL de muestra de la capa anteada en 15 mL de Ficoll-Paque.
   2. Centrifugar a 400 x g durante 20 minutos sin freno y recopilar la PBMC de la interfaz.
   3. Lavar las PBMCs recuperados tres veces mediante la adición de por lo menos un volumen igual de PBS, centri....

Resultados

Eficiencia de electroporación

Para optimizar la electroporación de Cas9/RNPs, probamos 16 programas diferentes con transducción de siRNA dirigidas no a GFP y plásmido de ADN en las células NK. Análisis de citometría de flujo mostraron que los EN-138 tenía el mayor porcentaje de viabilidad y transducción de la eficiencia de las células (células GFP vivo positivo de 35%) para ambas partículas (fi.......

Discusión

Modificación de ADN-dependiente de las células NK ha sido desafiante^4,9. Nosotros, por lo tanto, introduce directamente un complejo de ribonucleoproteína sintéticamente preformado (RNPs) y proteína Cas9 como purificado de la proteína primaria y ampliado de las células NK⁸. Este método nos permitió eliminar el recubrimiento de jales, y otros procesos transcripcionales y traduccional Iniciado por ARN polimerasa II, que puede causar apoptosis.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RosetaSep&comercio; Cóctel de enriquecimiento de células NK humanas	STEMCELL Technologies	15065	La rosetaSep™ El cóctel de enriquecimiento de células NK humanas está diseñado para aislar células NK de la sangre total mediante selección negativa.
Ficoll-Paque® PLUS	GE Healthcare - Ciencias de la Vida	17-1440-02
Alt-R® Las tecnologías integradas de ADN de CRISPR-Cas9 tracrRNA		1072532	TracrRNA que contiene modificaciones químicas patentadas que confieren una mayor resistencia a la nucleasa. Se hibrida a crRNA para activar la enzima Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	Tecnologías de ADN integradas		Producidas sintéticamente como Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, basado en la secuencia de ARNg diseñado dirigido al gen de intrest
Alt-R® Kit de detección de edición genómica	Tecnologías de ADN integradas	1075931	Cada kit contiene endonucleasa T7EI, tampón de reacción T7EI y controles de ensayo T7EI.
Platino® Taq ADN Polimerasa Alta Fidelidad	Invitrogen	11304-011
4D-Nucleofector™ Sistema	Lonza	AAF-1002B
Proteína IL-2 recombinante humana	Novartis	65483-0116-07
P3 Célula primaria 4D-Nucleofector&comercio; X Kit	Lonza	V4XP-3032	Contiene pmaxGFP™ Vector, Nucleofector&comercio; Solución, Suplemento, Nucleocuvette de 16 pocillos™ Tiras
no objetivo: siRNA personalizado, estándar 0.05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nucleasa 3NLS	Tecnologías de ADN integradas	1074181	Cas9 Nucleasa
DNeasy® Sangre & Manual de pañuelos	Qiagen	69504
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Calcein AM	ThermoFisher	C3099
TGFβ	Biolegend	580706
Alt-R® Kit de control CRISPR-Cas9,	tecnologías de ADN integrado	1072554	incluye tracrRNA, crRNA de control positivo HPRT, crRNA #1 de control negativo, mezcla de cebadores HPRT y tampón dúplex sin nucleasas.
IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)	Integrated DNA Technologies	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Potenciador de Electroporación	Tecnologías de ADN Integradas	1075915	Cas9 Potenciador de Electroporación

humano