Artículo de método

Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

DOI:

10.3791/58237

⸱

14 de junio de 2018

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1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para modificar genéticamente las células primarias o ampliadas humano naturales del asesino (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Mediante este protocolo, hemos generado las células NK humanas deficientes para el receptor 2 del factor de crecimiento-b de transformación (TGFBR2) y la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).

Resumen

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CRISPR/Cas9 tecnología está acelerando ingeniería del genoma en muchos tipos celulares, pero hasta el momento, genes y modificación genética estable han sido difíciles en primarias células de NK. Por ejemplo, entrega de transgenes mediante transducción retroviral o lentivirales dio lugar a una producción limitada de ingeniería genética de las células NK por sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células. Aquí describimos un método libre de ADN para la edición del genoma de humanos primarias y ampliadas las células NK mediante complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permite eficiente nocaut del TGFBR2 y HPRT1 genes en las células NK. Datos de RT-PCR demostraron una disminución significativa en el nivel de expresión del gen, y un ensayo de citotoxicidad de un producto representativo de la célula sugiere que las células NK modificado de RNP se hizo menos sensibles a TGFβ. Células genéticamente modificadas podrían ser ampliada post-electroporación por estimulación con mbIL21-expresando irradiado células de alimentador.

Introducción

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Inmunoterapia de cáncer se ha avanzado en los últimos años. Las células T antígeno quimérico genéticamente del receptor (coche) son un excelente ejemplo de ingeniería células inmunes desplegado en inmunoterapia del cáncer. Estas células fueron recientemente aprobadas por la FDA para el tratamiento contra CD19 + B de células malignas, pero éxito hasta el momento se ha limitado a enfermedades teniendo unos antígenos targetable y dirigidas a tal limitado repertorio antigénico son propensa al fracaso por escape inmune. Además, las células de T del coche se han enfocado en el uso de células de T autólogas debido al riesgo de enfermedad injerto contra – host causado por células T trasplante allogeneic. En contraste, las células NK son capaces de matar a objetivos de tumor de manera independiente del antígeno y no causan Eich, que hace un buen candidato para cáncer inmunoterapia6,7,8,9.

CRISPR/Cas9 tecnología ha sido utilizada recientemente en células inmunes ingeniería y reprogramar genéticamente las células NK con los plásmidos ha sido siempre un reto. Esto ha sido debido a las dificultades en la entrega del transgen de una manera dependiente de ADN como transducción retroviral y lentivirales causando sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células y la producción limitada de ingeniería genética de las células NK4 , 9.

Muchas células inmunes innatas expresan altos niveles de receptores para patrones moleculares asociados a patógenos como gen inducible por ácido retinoico me (RIG-I), que permiten una mayor reconocimiento de ADN extraño. Supresión de estas vías ha permitido una mayor eficiencia de transducción en las células NK al utilizar métodos basados en DNA para la modificación genética10.

Aquí describimos el método para el uso de un genoma de ADN libre edición de primarias y expansión humana las células NK utilizando complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs se compone de tres componentes, recombinante proteína Cas9 complexed con sintético RNA solo guía conformada por un complejo crRNA y tracerRNA. Estos Cas9/RNPs son capaces de unirse genómicas objetivos con mayor eficiencia en comparación con los enfoques de ADN-dependiente extranjeras debido a su entrega como complejos funcionales. Además, separación rápida de Cas9/RNPs de las células puede reducir los efectos off-target como inducción de la apoptosis. Por lo tanto, puede utilizarse para generar knock-out o knock-ins cuando se combina con el ADN por recombinación homóloga6,7. Demostramos que la electroporación de Cas9/RNPs es un método fácil y relativamente eficiente que supera las limitaciones anteriores de modificación genética en las células NK.

TGFβ es una citocina inmunosupresora importante, que inhibe la activación y funciones de las células NK. Se ha sugerido que dirigidas a la vía TGFβ pueden aumentar las funciones inmunes celulares. Hemos dirigido la región codificación ectodominio TGBR2 que une TGFβ11. Resultados representativos muestran una disminución significativa en el nivel de expresión del mRNA de este gen y además demuestran que las células NK modificadas volverse resistentes a los TGFβ. Además, las células modificadas retienen la viabilidad y potencial proliferativo, son capaces de ser post-electroporación ampliada utilizando células de alimentador irradiados. Por lo tanto, el método siguiente es un enfoque prometedor para manipular genéticamente las células de NK para cualquiera más clínico o con fines de investigación.

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Protocolo

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Buffy coats de donante sano se obtuvieron como material de la Central Ohio región Cruz Roja Americana. Esta investigación fue determinada para ser exento Investigación Hospital institucional Informe Junta de todo el país de los niños.

1. expansión y purificación de células NK humano

  1. Aislante PBMCs de la capa anteada12.
    1. Capa de 35 mL de muestra de la capa anteada en 15 mL de Ficoll-Paque.
    2. Centrifugar a 400 x g durante 20 minutos sin freno y recopilar la PBMC de la interfaz.
    3. Lavar las PBMCs recuperados tres veces mediante la adición de por lo menos un volumen igual de PBS, centrifugar a 400 x g durante 5 minutos y aspirando la PBC lavan. Células NK pueden ser aislado en esta etapa por el RosettesSep13.
  2. Expandir las células NK mediante la estimulación con irradiado 10 x 106 mbIL21-expresar las células de alimentador a los 0, 7 y 14 días. Sustituir los medios de comunicación con fresco RPMI con 10% FBS, 1% glutamina, 1% penicilina estreptomicina y 100 UI/mL de IL-2 para el volumen de los medios de comunicación todo cada día.

2. gRNA diseño y selección

  1. Elegir los loci genómicos específicos a destino, utilizando herramientas en línea, por ejemplo, NCBI, conjunto.
    Ejemplo.
    Descripción: Transformación del receptor del factor de crecimiento beta 2 (TGFBRR2) ectodominio
    Ver registro: PF08917
    Ver InterPro: IPR015013
    Posición: 49-157 aa
    Secuencia específica: Exón 4 del gen TGFBR2 (ENSG00000163513)
  2. Para diseñar los gRNAs, herramientas CRISPR diseño web tales como http://crispr.mit.edu y 'Benchling.'
    1. Entrar en la secuencia del ADN elegida en el paso 2.1. Elegir a humanos (hg 19) como un genoma de destino. Guías de CRISPR (20 nucleótidos seguido de una secuencia de PAM: NGG) sea sometido a análisis de la secuencia entrada antes. También se muestra a posibles coincidencias de objetivo por todo el genoma seleccionado.
    2. Elegir el mejor tres gRNAs que tienen el puntaje más alto, basado en sus tasas en meta y objetivo. Por ejemplo, la tabla 1 muestra los RNAs CRISPR diseñado a exón 4 del gen TGFBR2 sugerido por herramientas de CRISPR diseño web.
  3. Orden de los RNAs CRISPR como crRNAs sintético de secuencia-específica.
  4. Orden conservado, transactivating RNA (tracrRNA) para interactuar a través de la homología parcial con el crRNA.

3. diseño eliminación cartillas de evaluación

  1. Diseño de primers que abarca los sitios de clivaje gRNA para ensayo de mutación de T7E1.
  2. Bp de cartillas al menos 100 uso del sitio de la hendidura prevista para asegurar la inserción-deleción pequeña (indels) en el sitio de destino sgRNA aparecerá en gel de agarosa al 1,5% siguiendo el ensayo de mutación. La tabla 2 muestra los iniciadores que se utilizan para amplificar el ectodominio de TGFBR2.

4. transducción de las células NK humanas de primaria y ampliado

Nota: Transducción de Cas9/RNPs elementos en NK realiza electroporación con sistema 4D como sigue.

  1. Célula Preparación
    1. Para las células NK primarias, incubar células NK recién aisladas en Medio RPMI en presencia de 100 UI/mL de IL-2 por 4 días y realizar la electroporación en día 5. Sustituir los medios de comunicación todos los días como se describe anteriormente y el día antes de transducción de señales.
    2. Para las células NK expandidas, estimular las células en el día 0 con células de alimentador irradiados en una proporción de 1:1 y realizar la electroporación en día 5 o 6 o 7. Sustituir los medios de comunicación todos los días como se describe anteriormente y el día antes de transducción de señales.
    3. En el día de la electroporación, preparar un matraz T25 con 8 mL de RPMI fresco que contiene 100 UI/mL de IL-2 para las células que experimentaban la electroporación y frascos incubate previamente en un humidificado 37 ° C y 5% CO2 la incubadora.
      Nota: Las células descongeladas o células que han sufrido 2nd o 3rd estimulación pueden ser electroporated en cualquier momento después de su recuperación como se describe.
    4. Tomar 3-4 x 106 células por condición para 26 μl de mezcla de transducción de señales.
      Nota: Muy alta concentración de las células NK en la solución de electroporación mejora la tasa de transducción de señales.
    5. Lavar las células 3 veces con PBS para eliminar todos los FBS, que comúnmente contiene actividad Rnasa. Los hace girar cada vez a 300 x g durante 8 minutos.
      Nota: Tener en cuenta 7 condiciones de electroporación para Cas/RNPs como una gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) y una combinación de dos gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 gRNA3, gRNA2 + gRNA3) y un control con ningún Cas9/RNPs.
  2. Formar el crRNA:tracerRNA / complejo
    1. Resuspender el crRNAs (gRNA1, gRNA2 y gRNA3) y tracerRNA en solución a concentraciones finales de 200 μM de TE 1 x. 2.2 mezcla μL de cada gRNA 200 μM con 200 μM tracerRNA como se muestra en la tabla 3.
    2. Calentar las muestras a 95 ° C por 5 min y dejar para enfriar sobre la mesa a temperatura ambiente (15-25 ° C). Tienda resuspendió RNAs y crRNA: tracerRNA/complejo a-20 ° C para su uso posterior.
  3. Formar el complejo RNP
    Nota:     para ahorrar tiempo, forman el compleja durante el lavado la RNP paso 4.1.5.
    1. Para crRNA:tracrRNA solo duplex reacción, diluir Cas9 endonucleasa a 36 μM como se muestra en el ejemplo en la tabla 4.
    2. Para la transducción de la combinación de crRNA:tracrRNA dúplex, diluir Cas9 endonucleasa a 36 μM como se muestra en el ejemplo de tabla 5.
    3. Añadir Cas9 endonucleasa a crRNA:tracrRNA dúplex lentamente mientras el remolino la punta de la pipeta, más de 30 s a 1 minuto.
    4. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Si no está listo para utilizar la mezcla después de la incubación, mantenga la mezcla en hielo hasta su uso.
  4. Electroporación
    1. Añadir el suplemento entero a la solución de electroporación P3 y mantenerlo a temperatura ambiente.
    2. Resuspender el precipitado de células (3-4 x 106 células de paso 4.1.5) en 20 μL de solución de electroporación de D 4 primaria P3. Evitar las burbujas de aire mientras el pipeteo.
      Nota: las celdas no deben dejarse durante mucho tiempo en la solución de P3.
    3. Inmediatamente añadir 5 μl de complejo RNP (paso 4.3) a la suspensión de células.
    4. Añadir 1 μL de 100 μM Cas9 electroporación el reforzador a la Cas9/RNPs/celda de la mezcla.
    5. Transferencia de mezcla Cas9/RNPs/cell en tiras de electroporación de 20 μL.
    6. Golpee suavemente las tiras para asegurarse de que la muestra cubre la parte inferior de las tiras.
    7. Iniciar sistema de electroporación de 4D y elegir el programa EN-138 .

5. post transducción

  1. Que las células descansar durante 3 minutos en las tiras.
  2. Añadir 80 μl de los medios de cultivo previamente equilibrado a la cubeta y suavemente, transferir la muestra en matraces.
  3. 48 horas después de la transducción de señales, extraer la DNA de genomic de 5 × 105 células para las canceladuras del gene de detección.
  4. Amplificar el gen de interés utilizando los cebadores diseñados en el paso 3.2 con kits de Taq ADN polimerasa.
  5. Forma de heterodúplex de amplicones PCR para la digestión T7EI e incubar el producto durante 30-60 minutos con una enzima T7EI en 37 ° C.
    Nota: El T7EI es preferido para la detección es rápida, simple y proporciona limpiar resultados de electroforesis en comparación con el ensayo de topógrafo. Sin embargo, este método no puede detectar inserciones y canceladuras de < 2 bases que son generados por no homóloga se terminan uniendo actividad (NHEJ) Cas9 RNPs experimentos14.
  6. Ejecutar el ADN digerido en 1.5% gel de agarosa a 110 V de 30-45 minutos, cada 15 minutos visualizar el gel.
  7. Estimular el resto de las células con expresión de mbIL21 células de alimentador en una proporción de 1:1.
  8. Cinco días después de la estimulación extraer el ARN para el nivel de expresión génica utilizando qPCR.
  9. Ensayos de conducta calceína según lo divulgado previamente12. Brevemente, cargar las células de la blanco con calceína AM (en el ejemplo mostrado, se utilizó las células DAOY de 3 μg/mL/1.000.000). Preparar las células de NK para los ensayos de citotoxicidad por descansar durante la noche en IL2 (100 UI/mL) más o menos 10 ng/mL solubilidad TGFβ. Realizar ensayos de calceína en las mismas citoquinas como las células NK se descansaban en la noche a la mañana.

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Resultados

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Eficiencia de electroporación

Para optimizar la electroporación de Cas9/RNPs, probamos 16 programas diferentes con transducción de siRNA dirigidas no a GFP y plásmido de ADN en las células NK. Análisis de citometría de flujo mostraron que los EN-138 tenía el mayor porcentaje de viabilidad y transducción de la eficiencia de las células (células GFP vivo positivo de 35%) para ambas partículas (fi...

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Discusión

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Modificación de ADN-dependiente de las células NK ha sido desafiante4,9. Nosotros, por lo tanto, introduce directamente un complejo de ribonucleoproteína sintéticamente preformado (RNPs) y proteína Cas9 como purificado de la proteína primaria y ampliado de las células NK8. Este método nos permitió eliminar el recubrimiento de jales, y otros procesos transcripcionales y traduccional Iniciado por ARN polimerasa II, que puede causar apoptosis...

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Divulgaciones

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DAL sirve ha servido como consultor para Courier Therapeutics, terapéutica de obsidiana, Intellia Therapeutics, Merck Research Laboratories y Miltenyi Biotec y tiene participación, liderazgo en la terapéutica de CytoSen.

Agradecimientos

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Reconocemos Brian Tullius para su ayuda en editar el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RosetaSep&comercio; Cóctel de enriquecimiento de células NK humanasSTEMCELL Technologies15065La rosetaSep™ El cóctel de enriquecimiento de células NK humanas está diseñado para aislar células NK de la sangre total mediante selección negativa.
Ficoll-Paque® PLUSGE Healthcare - Ciencias de la Vida17-1440-02
Alt-R® Las tecnologías integradas de ADN de CRISPR-Cas9 tracrRNA1072532TracrRNA que contiene modificaciones químicas patentadas que confieren una mayor resistencia a la nucleasa. Se hibrida a crRNA para activar la enzima Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNATecnologías de ADN integradasProducidas sintéticamente como Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, basado en la secuencia de ARNg diseñado dirigido al gen de intrest
Alt-R® Kit de detección de edición genómicaTecnologías de ADN integradas1075931Cada kit contiene endonucleasa T7EI, tampón de reacción T7EI y controles de ensayo T7EI.
Platino® Taq ADN Polimerasa Alta FidelidadInvitrogen11304-011
4D-Nucleofector™ SistemaLonzaAAF-1002B
Proteína IL-2 recombinante humanaNovartis65483-0116-07
P3 Célula primaria 4D-Nucleofector&comercio; X KitLonzaV4XP-3032Contiene pmaxGFP™ Vector, Nucleofector&comercio; Solución, Suplemento, Nucleocuvette de 16 pocillos™ Tiras
no objetivo: siRNA personalizado, estándar 0.05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nucleasa 3NLSTecnologías de ADN integradas1074181Cas9 Nucleasa
DNeasy® Sangre & Manual de pañuelosQiagen69504
RNeasy Mini KitQiagen74104
Calcein AMThermoFisherC3099
TGFβBiolegend580706
Alt-R® Kit de control CRISPR-Cas9,tecnologías de ADN integrado1072554incluye tracrRNA, crRNA de control positivo HPRT, crRNA #1 de control negativo, mezcla de cebadores HPRT y tampón dúplex sin nucleasas.
IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)Integrated DNA Technologies11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Potenciador de ElectroporaciónTecnologías de ADN Integradas1075915Cas9 Potenciador de Electroporación
humano

Referencias

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