Caracterización de microbioma marca Next-Generation 16S rRNA Amplicon ordenando

Resumen

Aquí presentamos un protocolo de secuenciación de próxima generación para la secuenciación de rRNA 16S que permite la identificación y caracterización de comunidades microbianas en vectores. Este método implica la extracción de ADN, amplificación y código de barras de muestras mediante PCR, secuenciación en una celda de flujo y bioinformática para que coincida con los datos de la secuencia a la información filogenética.

Resumen

En décadas recientes, enfermedades transmitidas por vectores han resurgido y ampliado en alarmantes índices, causando considerables morbosidad y mortalidad en todo el mundo. Carecen de vacunas eficaces y ampliamente disponibles para la mayoría de estas enfermedades, haciendo necesario el desarrollo de estrategias de mitigación de la enfermedad de nuevo. Para ello, una prometedora vía de control de enfermedades implica orientación el microbioma del vector, la comunidad de microbios que habitan en el vector. El microbioma vector desempeña un papel fundamental en la dinámica de patógeno, y las manipulaciones de la microbioma han llevado vector reducido abundancia o patógeno de transmisión por un puñado de enfermedades transmitidas por vectores. Sin embargo, traducir estos resultados en aplicaciones de control de la enfermedad requiere un conocimiento profundo de la ecología microbiana del vector, históricamente limitada por la escasa tecnología en este campo. El advenimiento de métodos de secuenciación de última generación ha permitido la secuenciación rápida, altamente paralela de diversas comunidades microbianas. Dirigidas a gene del rRNA 16S altamente conservadas ha facilitado las caracterizaciones de los microbios presentes en vectores bajo diferentes condiciones ecológicas y experimentales. Esta técnica consiste en la amplificación del gen 16S rRNA, muestra de código de barras mediante PCR, las muestras de la carga en una celda de flujo para la secuencia, y bioinformática se acerca para que coincida con los datos de la secuencia con información filogenética. Especie o género nivel identificación de un número elevado de repeticiones se logra normalmente a través de este enfoque, así evitar problemas de baja detección, resolución y salida de cultivo tradicional, microscopía y tinciones histológicas técnicas. Por lo tanto, este método es adecuado para la caracterización de vectores de microbios en condiciones diversas pero actualmente no puede proporcionar información sobre la función microbiana, ubicación dentro del vector, o respuesta al tratamiento antibiótico. En general, secuenciación de próxima generación de 16S es una técnica poderosa para la mejor comprensión de la identidad y el papel de los microbios del vector en la dinámica de la enfermedad.

Introducción

El resurgimiento y propagación de enfermedades transmitidas por vectores en las últimas décadas plantean una grave amenaza para la salud humano y fauna mundial. Carecen de vacunas efectivas para la mayoría de estas enfermedades, y control de esfuerzos se ven obstaculizados por la naturaleza biológica compleja de interacciones host vector y vectores. Entender el papel de las interacciones microbianas dentro de un vector en la transmisión del patógeno puede permitir el desarrollo de estrategias novedosas que sortear estos desafíos. En particular, las interacciones entre vector asociado microbios comensales, simbiontes y patógeno, conocido como el microbioma, pueden tene....

Protocolo

1. recolección y esterilización superficial de la señal

1. Recoger garrapatas arrastrando un paño de 1 m² blanco por un hábitat asociados de garrapata, quitar garrapatas atado a especie, o cría de garrapatas en el laboratorio^15,16. Usar pinzas finas para manipular las garrapatas y almacenarlas a-80 ° C.
2. Coloque las garrapatas en los tubos PCR individuales y eliminar contaminantes de la superficie con un vórtex durante 15 s con 500 μL de peróxido de hidrógeno (H₂O₂), etanol al 70% y ddH₂O.
3. Poner las garrapatas en un nuevo tubo PCR y déjelos ....

Resultados

Un total de 42 garrapatas de huevo separadas tres garras y dos periodos de exposición ambiental, 0 y 2 semanas en el suelo, se procesaron para la secuencia del microbioma. Cada grupo de tratamiento, considerado como una sola vez el embrague y exposición, figura 6-8 muestras de garrapata de replicar. Estos extractos de garrapatas procesados fueron cargados en un secuenciador de última generación y rendido 12,885,713 Lee extremo apareado pasando el filtro. En esta prueba se incluyeron 3 con.......

Discusión

Generación de secuenciación del 16S rRNA ha convertido en un enfoque estándar para la identificación microbiológica y permitió el estudio de cómo microbiomes vector afectan la transmisión de patógeno. El protocolo descrito aquí detalla el uso de este método para investigar la Asamblea de la comunidad microbiana en I. pacificus, una especie de vector para la enfermedad de Lyme; sin embargo, fácilmente puede ser aplicado para el estudio de otras especies de garrapatas o especies de artrópodos vectores.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Artículo	Nombre del Material/Equipo Catálogo de	la Compañía	#
1	DNeasy Blood & Kit de Tejido	Qiagen	69504
2	Qubit 4 Fluorímetro	ThermoFisher Scientific	Q3326
3	NanoDrop 8000 Espectrofotómetro	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP perlas	Agen Court	A63880
6	Rack magnético	ThermoFisher Scientific	MR02
6	Tampón TE	Teknova	T0223
7	Nextera Index Kit	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA Kit de cuantificación de bibliotecas Roche		KK4824
9	MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001
	11 10 mM Tris-HCl con 0.1% Tween 20	Teknova	T7724