Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

Resumen

Este protocolo describe un método neto basado en el molde para crear los tejidos cardiacos libre de andamio tridimensionales satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza.

Resumen

Este protocolo describe un novedoso y fácil método neto basado en el molde para crear tejidos cardiacos de tridimensional (3D) sin material de andamio adicional. Cardiomiocitos de derivados de células madre humanas pluripotentes (iPSC-CMs), fibroblastos cardiacos humanos (HCF) y las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs) son aisladas y utilizadas para generar una suspensión con 70% iPSC-CMs, HCF de 15% y 15% HUVECs. Son cultivadas conjuntamente en un sistema de fijación ultra baja "gota colgante", que contiene microporos para cientos de esferoides de condensación a la vez. Las células agregan y espontáneamente forman esferoides paliza después de 3 días de cocultivo. Los esferoides son cosechadas, sembrados en una cavidad de molde novela y cultivadas en un agitador en la incubadora. Los esferoides se convierten en un tejido funcional maduro aproximadamente 7 días después de la siembra. Los tejidos resultantes de varias capas consisten en esferoides fusionadas con satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza. Este nuevo método tiene potencial prometedor como un método reproducible y rentable para crear tejidos diseñados para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca en el futuro.

Introducción

El objetivo de la actual ingeniería de tejido cardiaco es desarrollar una terapia para reemplazar o reparar la estructura y función del tejido miocárdico lesionado¹. Métodos para crear modelos 3D tejido cardiaco exhibe las propiedades importantes de contráctiles y electrofisiológicas del tejido cardiaco nativa han estado ampliando rápidamente^2,3. Una variedad de estrategias han sido exploradas y utilizadas en los estudios^4,5. Estos métodos entre el uso de específicos hidrogeles bioactivos naturales y sintéticos, tales como gelatina, colágeno, fibrina y péptidos⁶, y deposición del bio-tinta tecnologías tecnologías² y bioprinting⁷.

Se ha demostrado que métodos libres de andamio pueden producir tejidos comparables como métodos basados en el biomaterial, sin los inconvenientes de la incorporación de material de andamio exterior⁸. Oren Caspi et al demostraron que la incorporación de varios tipos de células permite la generación de tejido cardiaco ingeniería humana altamente vascularizado⁹. Chin et al. desarrolló un método de impresión 3-d para la creación del parche cardiaco de esferoides. Parches que se componen de cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales en un cociente de 70:15:15¹⁰. Esferoides han demostrado ser eficaces "building blocks" de la creación de tejido cardíaco libre de andamios, ya que son resistentes contra la hipoxia y poseen suficiente integridad mecánica para la implantación de^11,12. Estudios anteriores han demostrado varios métodos de fabricación para la creación de esferoide, incluyendo el uso de las que cuelgan de la gota método, spinner frascos¹³, sistemas de microfluidos¹⁴y cultura no adherente superficies sin revestir o revestidos con micro-moldes de agarosa¹⁵. En este protocolo, se utiliza el colgante gota dispositivo, que contiene microporos para cientos de esferoides de condensación a la vez.

Este estudio presenta un novedoso y eficaz método de andamio-libre para la creación de tejido cardíaco, que incluye siembra manualmente los esferoides en la cavidad de un molde cuadrado y el tejido en un agitador de incubación para la maduración. Bajo condiciones de cultivo estático habitual, difusión de oxígeno está limitada a los aspectos exteriores de la construcción de tejido, resultando en necrosis central. Sin embargo, con el molde de red, todos los esferoides sembradas en el molde están inmersos en los medios de comunicación con un constante movimiento fluídico, permitiendo para la mayor difusión de nutrientes y oxígeno. Además, este método basado en el molde permite la creación simultánea de parches de tejido de diferentes tamaños con el mínimo esfuerzo manual y el tejido resultante se puede quitar fácilmente del molde. Este novedoso método permite la creación eficiente y reproducible de parches cardíacos libre de andamio, de varias capas.

Protocolo

1. preparación de cardiomiocitos

1. Placas de 6 pocillos capa con membrana del sótano matriz y cultura humanas pluripotentes células (hiPSCs) como describieron anteriormente¹⁷.
2. Se diferencian hiPSCs en hiPSC-CMs usando métodos previamente descritos¹⁸.
3. En la diferenciación posterior de 16-18 d, suspender los cardiomiocitos aclarando cada pocillo con 2 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) sin calcio ni magnesio, seguido por la incubación con 1 mL/pozo de tripsina o celular reactivo de disociación (ver tabla de Materiales) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Neutralizar el reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) con un volumen igual de los medios de comunicación celular de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complementado con B-27 (media de células RPMI/B-27). Pipetee hacia arriba y hacia abajo para aflojar las células adheridas.
5. Recoger los cardiomiocitos suspendidos con una pipeta serológica de 10 mL y transferir a un tubo cónico de 50 mL.
6. Centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un precipitado de células.
7. Resuspender el precipitado en 10 mL de RPMI/B-27 celular medio.
8. 20 μl de la suspensión celular se combinan con una cantidad igual de solución de azul de tripano 0.4% y mezclar suavemente.
9. Usar un hemocitómetro manual para contar y obtener la viabilidad concentración y celular de la suspensión de células.

2. preparación de los fibroblastos

1. Iniciar una cultura de una línea de células del fibroblasto cardiaco humano (HCF) (tipo ventricular adulto) como se describe anteriormente¹⁶.
2. Suspender el HCF por incubación con una cantidad apropiada del reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) durante 5 minutos a temperatura ambiente¹⁶. Para un frasco T175, 10 mL de reactivo de disociación tripsina o célula se utilizó.
3. Neutralizar el reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) con un volumen igual de medio, luego transferir la muestra a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un pelotilla.
4. Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de crecimiento del fibroblasto (véase Tabla de materiales).
5. 20 μl de la suspensión de células HCF se combinan con una cantidad igual de solución de azul de tripano 0.4% y mezclar suavemente.
6. Usar un contador de células automatizado o manual hemocitómetro para contar y obtener la viabilidad concentración y celular de la suspensión de células nuevas.

3. preparación de células endoteliales

1. Iniciar una cultura de una línea de células endoteliales (HUVEC) de la vena umbilical humana tal como se describe anteriormente¹⁷. Suspender las HUVECs por incubación con una cantidad apropiada del reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) por 3 min a temperatura ambiente¹⁷. Neutralizar el reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) con un volumen igual de medio, luego se transfieren a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un pellet.
   Nota: Para un matraz T175, 10 mL de reactivo de disociación tripsina o célula se utilizó.
2. Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de cultivo de células endoteliales (véase Tabla de materiales).
3. 20 μl de la suspensión HUVEC se combinan y la mancha con una cantidad igual de solución de azul de tripano 0.4% y mezclar suavemente.
4. Usar un contador de células automatizado o un hemocitómetro manual para contar y obtener la viabilidad concentración y celular de la suspensión de células.

4. creación de colgante gota esferoides

1. Colocar el colgante gota dispositivo que contiene 850 microporos (cada uno con un diámetro de 350 μm) en placas de 6 pocillos estériles.
2. Aislar los tres tipos de células como se describe anteriormente: hiPSC CMs, HCF y HUVECs. Combinar en una proporción de 70% iPSC-CMs, 15% de HCF y HUVECs 15% en un tubo cónico de 50 mL con RPMI/B-27 los medios de comunicación de la célula a una concentración de 2.475.000 células por mL.
3. Pipetear 4 mL de la suspensión celular (2.475.000 células por mL) a cada pocillo de un accesorio ultra bajo colgante sistema (con un diámetro del microporo de 350 μm) en una placa de 6 pozos.
4. Esferoides se forman espontáneamente dentro de 12 h de dispensar la suspensión de células en el colgante gota dispositivo. Continuar a la cultura para un total de 72 h (3 d) a 37 ° C, 5% CO₂y 95% de humedad para la maduración de los esferoides.
5. Después de 72 h de cultivo, cosecha de los esferoides a través de los poros en la parte inferior de las que cuelgan gota sistema colocando el dispositivo en un plato con medio y girando suavemente para soltar los esferoides de colgar dispositivo gotas.

5. creación de parche 3D utilizando el nuevo molde neto

1. La base, plato cuadrado inferior, red de fondo y 10 capas lado redes se ensamblan para crear el molde de la novela con la ayuda de un par de pinzas estériles. En primer lugar, pila de alinear la base, plato cuadrado inferior y fondo net usando los postes esquineros. Luego, la pila y las redes 10 lado alternando direcciones para crear una red de finas patas de acero inoxidable de la capa.
2. Eliminar el relleno base con PBS o medio para reducir la tensión superficial y, a continuación, transferir el molde montado en la base del relleno.
3. Húmeda la cavidad del molde neto con PBS o medio en el mismo método. Llenar lentamente los esferoides en la cavidad presupuesta del tamaño deseado (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 m, o 6 x 6 x 1 mm).
   Nota: Asegúrese de que el 120% del volumen esperado de esferoides se alimenta en la cavidad para que los agregados de la célula están en estrecha conexión y permanecer estáticos.
4. Montar el top red placa superior y cuadrada en los postes esquineros y asegure los tapones y tubos de retención para prevenir el lavado de los esferoides.
5. Transferir el sistema de llenado de molde neta a una placa de la pozo de 6 con 6 mL de RPMI/B-27 medios de célula o en un recipiente estéril con suficiente medio para cubrir el molde montado todo.
6. Incubar la placa de la pozo de 6 con el sistema de llenado del molde en un agitador oscilante durante 7-10 días a 3.000-4.000 x g.
   Nota: La duración de la incubación se decide por el tamaño de los parches cardíacos. Con los parches más grandes, el tiempo de incubación deberá aumentarse para maduración de parche cardiaco.

6. eliminación de la versión de la novela neta molde

1. Desmontar el molde de los medios de comunicación y colóquelo en la estera de esterilizados manejo en un recipiente estéril de 10 cm.
2. Retire el tubo, tapones, la placa superior del cuadrado y la red superior. Cuidadosamente Deslice el lado capas redes uno por uno con un par de pinzas estériles. Después de la decanulación, se obtiene un parche cardiaco intacto encima de la red de fondo.
3. Coge la red de fondo con el parche utilizando pinzas estériles y transferir la red de fondo en una placa de 35 mm con 5 mL de Medio RPMI/B27. Aflojar el parche de la red de fondo suavemente agitando lentamente la red en el plato, o con un raspador estéril de la célula. Después de la separación de la red de fondo, el tejido cardiaco puede ser cultivado con medios RPMI/B27.
4. Seguir a incubar el parche cardiaco 3D flotan libremente en el plato de 35 mm. Paliza sincrónica funcional puede observarse tan pronto como 24 horas después del retiro del molde.
5. Después de quitar el parche del molde de red, tenga en cuenta que su forma se mantiene con la integridad y la intensidad del latido sincrónico aumenta con el tiempo.
   Nota: Los parches cardiacos basados en molde red 3D exhibieron la integración eléctrica de componente cardiospheres después del decannulation. Se observó una frecuencia de golpeo que van de 60 a 80 pulsaciones por minuto que persistió por más de 60 días.

Resultados

En nuestros experimentos, se utilizó una suspensión de iPSC-CMs 70%, 15% HCF y HUVECs 15% en medios de comunicación de células RPMI/B-27 a una concentración de 2.475.000 células por mL. Después de crear la suspensión de células, nos dispensa 4 mL de la suspensión celular en cada pocillo de un accesorio ultra bajo suspensión sistema, tal como se describe en el paso 4.3 del protocolo. El uso de colgar sistema dio lugar a la formación espontánea de cientos de vencer a esferoides después de 3...

Discusión

La importancia de este método radica en su reproducibilidad y la eficacia del tejido cardiaco resultante de varias capas. En el campo de la ingeniería de tejido cardiaco, uno de los objetivos actuales es identificar un método para crear parches cardíacos 3D golpes, varias capas y funcionales. Divulgamos un método eficiente y reproducible de la creación de varias capas de tejidos cardiacos por siembra manual directa de esferoides compuestos de cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos en un nuevo molde neto. El ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fibroblastos cardíacos humanos (HCF)	Sciencell	6310
FM-2 consta de medio basal	Sciencell	2331	HCF medio de cultivo
Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)	Lonza	CC-2935
EGM+Bullet Kit	Lonza	CC5035	HUVEC medio de cultivo
E8 media	Invitrogen	A1517001	medio de cultivo HiPSC
Geltrex	Invitrogen	A1413202
Enzima TrypLE Express (1X)	Thermo Fisher	12604013	Reactivo de tripsina y disociación celular
Medios RPMI	Los medios Invitrogen	11875093	RPMI con el suplemento B-27 son medios de cultivo hiPSC-CM
Suplemento B-27 (50x)	Thermo Fisher	17504044	Los medios RPMI con suplemento B-27 son medios de cultivo hiPSC-CM
Azul Trypan Solución, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Nuevo molde de red	TissueByNet Co.,Ltd	NM25-1
Placa colgante	Kuraray Co.,Ltd	MPc350
6 placas de pocillos	Sigma-Aldrich	CLS-3516