Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

Resumen

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Resumen

Ha sido un reto para los científicos expresar proteínas recombinantes de eucariotas secretores para estudios estructurales y bioquímicos. El sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada es uno de los sistemas utilizados para expresar proteínas secretoras eucarióticas recombinantes con algunas modificaciones poste-de translación. Las proteínas secretoras que deba canalizarse a través de las vías secretoras de glycosylation de la proteína, formación de enlaces disulfuro y otras modificaciones poste-de translación. Para mejorar la expresión de células de insectos existentes de proteínas secretoras de vegetales, un vector de expresión de baculovirus se modifica por la adición de un GP67 o una secuencia de péptido señal hemolin entre el promotor y la clonación de múltiples sitios. Este sistema de nuevo diseño vector modificado había producido con éxito un alto rendimiento de proteínas de receptor soluble recombinante planta secretada de Arabidopsis thaliana. Dos de las proteínas de la planta expresada, los dominios extracelulares de los receptores de membrana plasmática de Arabidopsis TDR y PRK3, se cristalizaron para estudios cristalográficos de rayos x. El sistema vector modificado es una herramienta mejorada que potencialmente puede ser utilizada para la expresión de proteínas recombinantes secretores en el reino animal también.

Introducción

Es imprescindible para un laboratorio de investigación ser capaces de producir grandes cantidades de proteínas recombinantes homogéneas para caracterizaciones bioquímicas y biofísicas, especialmente para estudios cristalográficos de rayos x. Existen muchos sistemas de expresión heteróloga bien establecido como Escherichia coli, levaduras, células de los insectos, células de mamíferos, células de la planta, etc. entre ellos, el sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada es uno de los más usan técnicas para producir grandes cantidades de proteínas eucarióticas recombinantes gran tamaño estructural plegadas para la cristalización de pro....

Protocolo

Nota: Se utiliza un sistema de células de insecto/baculovirus con vectores de expresión modificada de expresión de la proteína secretora de la planta y la cristalización.

1. modificación de un Vector de expresión de Baculovirus con el péptido de señal GP67 para la expresión de la secreción de la proteína de planta

1. Sintetizar un fragmento de ADN que contiene una 5' BglII corte sitio¹³, la secuencia de señal GP67 secreción y un sitio de clonación múltiple con NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI y XhoI (figura 1A).
   Nota: Puesto que BglII y BamHI digestión DNA dio l....

Resultados

Como se muestra en la figura 1, se utilizaron dos vectores de expresión de baculovirus modificados pFastBac1 para expresar las proteínas secretadas con la GP67 o la secuencia de señal hemolin para reemplazar la secuencia de la señal intrínseca de la gene de la blanco. GP67 viral y los genes de insectos hemolin han demostrado tener niveles de expresión de alta secreción en las células. Se espera que las proteínas de fusión con cualquiera de estas dos secuencia.......

Discusión

Dada la diversidad de tamaño y estabilidad de los miles de proteínas presentes en los sistemas biológicos, a menudo es empírica para la investigación de un laboratorio para decidir qué sistema de expresión heteróloga debe elegirse para la expresión de una proteína específica. El sistema de expresión de e. coli es a menudo la primera opción para la expresión de la proteína debido al corto ciclo de vida de las bacterias, bajo costos de los medios de cultivo y la relativa facilidad para escalar^19<.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agitador de incubadora	VWR	Modelo Excella E25	27 oC
Incubadora	VWR	Modelo 2005	27 oC
Centrífuga	BECKMAN	Modelo J-6	con rotor de cangilón oscilante
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600677-51	para la amplificación por PCR del ADN
Termociclador	BIO-RAD	Modelo C1000 Touch	Para la amplificación por PCR del ADN
Agitador de incubadora	New Brunswick Scientific	Model I 24	Para el cultivo de baceria
Síntesis de ADN del cliente	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	Endonucleasa de restricción
BglII	New England Biolabs	R0144S	Endonucleasa de restricción
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restricción Endonucleasa
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restricción Endonucleasa
T4 ADN ligasa	England Biolabs	M0202T	Ligadura de ADN
QIAquick Gel Kit de extracción	Qiagen	28704	Purificación de ADN a partir de gel Agorase
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen		27104	Purificación de ADN plasmídico a partir de cultivo de bacterias
Agarosa	Thermo Fisher Scientific	15510-019	Para electroferosis en gel de ADN
MAX Efficiency DH5α célula competente	Invitrogen	18-258-012	Para la transformación de la mezcla de ligadura de ADN
Lennox L LB Caldo	Producto de investigación International Corp.	L24066-5000.0	Para el cultivo de bacterias
Ampicilina sódica Sal	Thermo Fisher Scientific	11593-019	Antibióticos
Sulfato de Kanamicina	Thermo Fisher Scientific	15160-054	Antibióticos
Tetraciclina	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	Antibióticos
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	15710-064	Antibióticos
MAX Efficiency Células competentes DH10Bac	Thermo Fisher Scientific	10361-012	Para la fabricación de bacmid DNA
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544-034	Para la transformación del ADN
Reactivo CellFECTIN II	Thermo Fisher Scientific	10362-101	Reactivo de transfección de células de insectos
Bac-to-Bac Expression System	Thermo Fisher Scientific	10359-016 Kit de	expresión de células de insectos Baculovirus
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	Para el aislamiento de células de Bacmid DNA
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	Para el aislamiento de células Bacmid DNA
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	Vector de expresión de Baculorirus
Sf9	Thermo Fisher Scientific	11496015	Células monocapa Sf9
Células Hi5	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five células de insectos
Grace' s medio de insecto, sin suplementar	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 transfección de células medio mínimo
Grace' s medio para insectos, suplementado	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 medio completo de cultivo celular monocapa
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	Sf9 medio de cultivo celular en suspensión sin FBS
Express Five SFM	Thermo Fisher Scientific	10486025	Hi5 medio de cultivo celular
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10.000 U.I./ml)
L-Glutamina (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
Certificado FBS	Thermo Fisher Scientific	16000-044	500 ml
Placas de 6 pocillos	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B	Placas de fondo plano
150 mm	Thermo Fisher Scientific	353025	100/caja
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	USA Scientific	1415-2500	500 tubos/bolsa
Tubos centrífugos cónicos con tapón de rosca de 15 ml	USA Scientific	1475-0511	25 tubos/bolsa
Tubos centrífugos con tapón de rosca cónico de 50 ml	USA Scientific	1500-1211	25 tubos/bolsa
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Tiras indicadoras de pH de	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14

New de resina NiNTA