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Artículo de método

Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

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DOI:

10.3791/58285

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25 de octubre de 2018

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1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Descrito es la preparación de nanopartículas liposómicos antigénicas y su uso en estimular la activación de células B en vitro e in vivo. Respuestas de anticuerpos consistente y robusto condujeron al desarrollo de un nuevo modelo de la alergia del cacahuete. El protocolo para la generación de liposomas antigénicas puede ampliarse a los diferentes antígenos y vacunas.

Resumen

Respuestas de anticuerpos proporcionan inmunidad protectora crítica a una amplia gama de patógenos. Existe un gran interés en la generación de anticuerpos robustos para la vacunación, así como entender cómo patógeno anticuerpo respuestas desarrollan alergias y enfermedades autoinmunes. Generar respuestas de anticuerpos específicos del antígeno robusta no es siempre trivial. En modelos de ratón, a menudo requiere múltiples rondas de inmunización con adyuvante que conduce a una gran cantidad de variabilidad en los niveles de anticuerpos inducidos. Un ejemplo es en modelos de ratón de alergia a los cacahuates en modelos más robustos y reproducibles que minimicen el número de ratón y el uso de adyuvante sería beneficiosos. Presentado aquí es un modelo de ratón altamente reproducible de anafilaxis alergia del cacahuete. Este nuevo modelo se basa en dos factores clave: (1) específica de antígeno esplenocitos eventualmente se transfieren de un ratón sensibilizado de maní en un ratón receptor ingenuo, normalizando la cantidad de memoria específica de antígeno las células B y T a través de un gran número de ratones; y ratones receptores (2) posteriormente se refuerzan con un fuerte inmunógeno multivalente en forma de nanopartículas liposómicos mostrando el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2). La gran ventaja de este modelo es su reproducibilidad, que en última instancia, disminuye el número de animales utilizados en cada estudio, al tiempo que minimiza el número de animales que recibieron las inyecciones múltiples de adyuvante. El montaje modular de estos liposomas inmunogénicas proporciona relativamente fácil adaptabilidad a otros modelos alérgicas o autoinmunes que involucran anticuerpos patógenos.

Introducción

La alergia alimentaria afecta al 8% de los niños en los Estados Unidos y prevalencia se ha incrementado en los últimos decenio1. Alergia al maní afecta a 1% de los niños y no es típicamente pequeño2. Aunque varios prometedores ensayos clínicos están en marcha para el tratamiento de la alergia alimentaria, incluyendo inmunoterapia oral (OIT), la inmunoterapia sublingual (SLIT) y epicutánea inmunoterapia (EPIT), actualmente no hay estrategias de tratamiento aprobado por la FDA para individuos alérgicos a cacahuete3,4,5,6,7,8de desensibilización. Por lo tanto, personas alérgicas deben evitar estrictamente los alergenos para evitar la anafilaxia. Quedan muchos interrogantes en cuanto a vías de sensibilización y subyacente a los mecanismos de desarrollo de alergia alimentaria.

Modelos de ratón son una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de la alergia, así como desarrollar nuevos tolerogénicas y desensibilización terapias9,10,11,12. Esto es particularmente cierto porque el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2; Ah2) en seres humanos es también el alergeno dominante en varios descrito ratón modelos13,14. Mientras que los modelos de ratón de la alergia del cacahuete son invaluables en el estudio de los mecanismos de sensibilización y tolerancia, una desventaja es que puede ser variable y requieren el uso de adyuvantes. Inmunógenos más potente sería una forma de minimizar la variabilidad intrínseca de dichos modelos. Puesto que las células de B son fuertemente activadas por antígenos multivalentes, liposomas antigénicas mostrando el alérgeno son una buena opción debido a su capacidad para potencialmente activar células B a través de los receptores de células B (BCR) mientras que también tiene la propiedad de manera eficiente el compartimiento de las células T a través de ser tomado no específica de antígeno-presentación de cebado las células.

Aquí, describimos un protocolo detallado para antígenos de la proteína a la nanopartículas mediante una estrategia modular y fácil de conjugar. Utilizando un antígeno de suplente, fragmento Fab de anti-IgM, demostramos cómo potente estos liposomas antigénicas pueden ser en la activación de células B estimulante. Liposomas antigénicas con Ah2 antígeno fueron usados para desarrollar un nuevo modelo de ratón de confiere sensibilidad. En este modelo, los esplenocitos de ratones alérgicas cacahuetes verificadas, que contienen cacahuete específica memoria células B y T, se transfieren a ratones Congénicos de ingenuo. Inyección de liposomas conjugados con Ah2 en los ratones receptores, con el fin de inducir anticuerpos contra Ah2 induce respuestas de anticuerpos de memoria. Seguido por un único impulso con Ah2 soluble, anticuerpos específicos Ah2 dan lugar a una fuerte respuesta anafiláctica cuando estos ratones son desafiados posteriormente con Ah2. Ratones sometidos a la reacción alérgica responden de manera más uniforme y no han recibido un adyuvante, este enfoque es un modelo de alergia del cacahuete deseable y los resultados sugieren que puede tener utilidad en otros modelos de ratón impulsados por antígenos dirigidos a alérgenos y posiblemente autoantígenos.

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Protocolo

El método general de acoplamiento proteína lípidos y incorporar en liposomas se basa en gran parte en trabajo anterior15. Todos los procedimientos animales descritos a continuación han sido aprobados por la Universidad de Carolina del norte en la colina de la capilla institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC). Todos los ratones utilizados en el modelo de la alergia del cacahuete son hembras BALB/cJ compradas de 3 semanas de edad. El cuidado Animal de la Universidad de Alberta y el Comité uso (ACUC) aprobó experimentos relacionados con el uso de bazos de ratón para análisis ex vivo en ratones C57Bl/6 de al menos 6 semanas de edad.

1. Conjugación de la proteína antígeno lípido pegilado

  1. Añadir 3 g de perlas de gel dextran reticulado con un rango de fraccionamiento de 1.500 – 30.000 Daltons (Da) a un matraz kitasato de 250 mL. Añadir 60 mL de tampón fosfato salino (PBS) y revolver continuamente con una barra de agitación magnética. Sellar el frasco y coloque en un vacío para iniciar la desgasificación en una placa de agitación durante un mínimo de 1 h.
  2. En una columna de 1.0 cm x 30 cm vidrio cromatografía con el tope de facturación cerrado, añadir PBS a la columna para lavar. Abrir el tapón de la facturación y la columna de desagüe. Después de lavar, añadir la mezcla de granos de gaseado a la columna. Añadir continuamente la mezcla hasta que la columna se encuentra a una altura de grano de aproximadamente 24 cm.
  3. Una vez que la columna tiene una 'cabeza' de aproximadamente 4 – 5 cm de PBS por encima de los granos envasados, tienen los siguientes pasos listos.
    1. Crear un sifón de flujo de gravedad mediante la medición de una pieza de tubería lo suficientemente larga para llegar a un estante de 1 – 2 pies por encima de la parte superior de la columna y crear un bucle que cae cerca de la parte inferior de la columna y regresa a la parte superior de la columna. Añadir un tapón de facturación a un extremo de la tubería, dejando a un lado de la tubería abierta. Coloque el extremo del tubo abierto en una botella de 500 mL de PBS y el lugar en el estante encima de la columna.
    2. Tome el extremo con el tapón de la facturación y conectar una jeringa de 10 mL. Abra la válvula de tope de facturación en la línea de tubería y drenaje PBS a través del tubo. Una vez que la PBS ha alcanzado tres cuartas partes de la forma a través de la tubería, rápidamente Retire la jeringa y añadir el tope de facturación a la parte superior de la columna, líquido debe estar en ejecución en la columna.
      Nota: La cantidad de 'cabeza' de PBS en la parte superior de la columna de la izquierda debe estar entre 1 y 3 cm. La cantidad mínima para lavar la columna es de 3 volúmenes de columna.
  4. Determinar la cantidad de proteína (lunares) vincularse a lípidos basados en su peso molecular (MW).
    Nota: El fragmento Fab de cabra anti-ratón IgM (sí mismo una IgG) se utiliza aquí como un antígeno sustituto universal para la estimulación policlonal de células B. En consecuencia, el fragmento Fab de la IgG de cabra tiene un MW de aproximadamente 48 kiloDalton (kDa) y está comercialmente disponible en una cantidad total de 1,3 mg. Así, la cantidad de proteína relacionada es 27,1 μmol.
  5. Determinar el coeficiente de extinción de la proteína de interés. Si desconocido, medir la absorbancia de proteínas a 280 nm usando un espectrofotómetro y dividir el valor280 por el número de moles calculado en el paso 1.4.
    Nota: La extinción co-eficiente de Fab de cabra IgG a 280 nm es 64.600 M-1.
  6. Para asegurar que dibujan cantidades de amina que contiene tampón se retiran, desalar la proteína sobre la columna creada en pasos 1.1 – 1.3 y recoger fracciones de proteína en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (~ 500 μl por fracción).
    1. Cierre la válvula de tope de facturación conectada a la parte superior de la columna y quitar la parte superior de la columna. Si no ya abra, abra la válvula de tope de volumen en la parte inferior de la columna y espere hasta que la 'cabeza' de PBS golpea la parte superior de los granos.
    2. Agregue lentamente en la proteína de interés a la parte superior de los granos con un vidrio pipeta Pasteur, teniendo cuidado de reducir al mínimo disturbio a la parte superior de los granos.
    3. Una vez que la 'cabeza' de la solución de la proteína ha llegado a la parte superior de los granos, añadir 1 mL de PBS suavemente a través de una pipeta Pasteur. Repetir tres veces. Añadir PBS para crear una cabeza de 4 – 5 cm y repetir el paso 1.3 para lavar la columna.
      Nota: Este paso puede omitirse si es cierto que ningún búfer que contiene amina está presente.
  7. Determinar las fracciones que contienen proteína midiendo valores A280 y las fracciones que dan aproximadamente el 90% de recuperación de la proteína de la piscina.
    Nota: Normalmente esto diluye la proteína 1.5-2-fold. Determinar la concentración de proteínas después de la puesta en común. Concentrado de la proteína en este paso, si es necesario, utilizando un concentrador de centrifugación.
  8. Agregue 2.5 equivalente molar del crosslinker de heterobifunctional a la proteína.
    1. En primer lugar, pesan aproximadamente 5 mg de succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionato (SPDP, MW = 314 g/mol) en un tubo de microcentrífuga. Para determinar el volumen para disolver la SPDP, tome la concentración molar y multiplíquelo por 250 x para generar una solución de 100 x que le dará un exceso molar de 2,5 en la reacción.
      Nota: por ejemplo, si la concentración de proteína es de 50 μm, de SPDP 12,5 mm se necesita una solución. Para 5 mg de SPDP, esto corresponde a 1,27 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
  9. Añadir SPDP a la proteína de interés en una dilución 1: 100. Lugar la reacción en un agitador oscilante a temperatura ambiente (RT) por aproximadamente 1 h.
  10. Quitar exceso SPDP y proteger el enlace de disulfuro endógena, en la proteína en el paso subsiguiente reducción, equilibrar, y lavar la columna creada en los pasos 1.1 – 1.3 en 100 mM acetato de sodio (NaOAc) a pH 5.5 o crear una columna idéntica exclusivamente para uso en este memoria intermedia.
  11. Después de 1 h de incubación con SPDP, desalar la proteína en la columna equilibrada en 100 mM NaOAc. Llevar a cabo este paso de la misma manera como paso 1.6 excepto usando 100 mM NaOAc (pH 5.5) como eluyente. Recoger las fracciones, determinar A280y las fracciones superiores de la piscina. Lavar la columna en PBS.
  12. Preparar una solución de 2,5 M de la TDT (MW = 154 g/mol) en doble destilado agua (ddH2O). Añadir 25 mM TDT a las fracciones combinadas de proteínas de 5-10 minutos.
  13. Mida A280 de la proteína y esta divida por el coeficiente de extinción. También, determinar A343. Calcular la relación vincular basada en la molaridad de la proteína (un280) y linker (A343).
    Nota: Desactivar la calibración automática del A340 si usando un espectrofotómetro nanodrop. La medición343 representa la absorbancia del grupo piridina 2-Tiona (coeficiente de extinción = 7550 M-1) que es eliminado de la vinculante SPDP por la TDT. Un cociente molar de vinculador: relación de 1.2 – 1.5 generalmente se logra al realizar la reacción con un 2.5 exceso molar de SDPD en una amplia gama de proteínas.
  14. Ejecutar las fracciones agrupadas sobre la columna de lavado en PBS como se describió anteriormente. Recoger las fracciones, determinar A280y fracciones superiores de la piscina. Determinar la concentración de proteína por A280 después de agrupación de las fracciones.
  15. Preparar DSPE-PEG (2000)-maleimida (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-maleimida. Esto se añadirá a la proteína en una proporción molar de 10:1. Preparar un stock de 100 x de DSPE-PEG (2000)-maleimida para alcanzar la concentración deseada.
    1. Por ejemplo, si la concentración de proteína es 10 μm después de paso 1.14, preparar un caldo de DSPE-PEG (2000)-maleimida en 10 mM. Pesar cuidadosamente DSPE-PEG (2000)-maleimida (MW = 3000 g/mol) y añadir la cantidad apropiada de DMSO. Múltiples rondas de Vortex suave y sonicando pueden conseguirlo completamente disuelto.
  16. Determinar el volumen total de las fracciones de paso 1.14 y transfiera la solución cuidadosamente a un pequeño (10-25 mL) ronda matraz de fondo (FBR). Añadir la cantidad apropiada de 100 x DSPE-PEG (2000)-maleimida a la proteína para lograr un 1 x, 10 veces concentración molar de exceso, final. Agite suavemente la solución para asegurarse de que el DMSO es totalmente dispersa.
  17. Ejecutar la reacción durante la noche bajo nitrógeno en un RBF sellado. Utilizar una membrana de goma y colocar en una campana de humos.
    1. Quite la atmósfera pinchando el tabique con una aguja de 20 G conectada a una jeringa de 3 mL en el extremo del tubo atado vacío y gire en vacío de 3 a 5 s.
    2. Reemplazar la atmósfera con el nitrógeno. Llene un globo conectado a una jeringa de 3 mL por la mitad con nitrógeno y conecte una aguja de 20 G. Punción del septo para llenar la atmósfera dentro del matraz de fondo redondo con nitrógeno. Repetir la extracción de la atmósfera y el reemplazo con nitrógeno una vez más y dejar el balón de nitrógeno conectado toda la noche.
  18. Preparar una columna de grano de gel dextran reticulado separada con un rango de fraccionamiento de 4.000 – 150.000 Da en una columna de cromatografía de vidrio de 1.0 cm x 50 cm (según medidas 1.1-1.3).
  19. Al día siguiente, quitar la proteína desde el matraz de fondo redondo preparado en el paso 1.17 y run (seguir el método utilizado en el paso 1.6) sobre la columna de perla gel dextran reticulado (del paso 1.18).
    Nota: El monto total a cargar en la columna debe ser no más de 2 mL. Si se utiliza una reacción más grande, dividido en dos y correr en columnas separadas o en una columna de diámetro más grande.
    1. Recoger las fracciones, determinar la A280, fracciones superiores de la piscina y determinar la concentración de proteína. La presencia de los lípidos no afectará las medidas.
  20. Almacenar las fracciones combinadas finales de proteína lípidos vinculados a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.

2. preparación de liposomas

  1. Pesar los lípidos: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; Colesterol (3b-hidroxi-5-cholestene, 5-colesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol; y DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/bandeo crear una solución de 5 mg/mL de DSPC, solución 4 mg/mL de colesterol y 2 mg/mL de solución de DSPE-PEG(2000) en cloroformo.
  2. Asegurar que la relación molar de lípidos en los liposomas: 57% DSPC 38% colesterol y 5% DSPE-PEG(2000), según lo representado en la tabla 1.
    Nota: Es importante controlar la cantidad de antígeno en los liposomas, que generalmente oscila entre 0.01 – 0.1%. En la tabla 1, se utiliza el 0.1% de cabra anti-ratón fragmento IgM Fab ligado a pegilado lípidos. Es fundamental tener en cuenta de la muela 10 veces exceso de DSPE-PEG (2000)-maleimida que se agregó a la proteína de paso 1.15, para asegurar que la cantidad total de lípidos pegilado no exceda del 5%.
  3. Considerar las cantidades de lípidos final (μmol) al crear los lípidos para extrusión. Vea la tabla 1 para obtener un ejemplo de cálculo de las concentraciones de lípidos molar para la creación de liposomas en una concentración de lípido total 1,25 μm.
  4. Una vez se ha calculado la cantidad correcta de cada lípido a se suman, combinan todos en un tubo de ensayo de vidrio borosilicato de 12 mL.
  5. Sople con cuidado el cloroformo.
    1. Use el tubo y una jeringa de 3 mL con aguja, preparada en el paso 1.17.1, soplar cuidadosamente de cloroformo en el tubo de nitrógeno. Suénese suavemente la corriente de nitrógeno en la solución mientras gira el tubo con la otra mano. Tenga cuidado minimizar salpicaduras o causando el líquido a correr camino hasta el lado del tubo que sea más difícil llegar a esta solución en el siguiente paso.
  6. Añada 100 μl de DMSO a cada tubo y liofilizar esta solución durante la noche. Cubrir la parte superior del tubo con un trapo de laboratorio no estático, seguro con una banda elástica y congelar a-80 ° C.

3. liposomas extrusión

  1. Añadir 1 mL de PBS con la proteína lípidos vinculados al tubo de 12 mL que contiene los lípidos. Someter a ultrasonidos la solución por aproximadamente 30 s a 1 min en un baño de sonicación. Descansar durante 5 minutos o más entre cada ronda y repetir 3-4 veces.
  2. Preparar una extrusora lo indicado por el fabricante.
    1. Añadir los soportes del filtro en el soporte de la membrana interna, coloque unas pocas gotas (10 μl) de PBS en la película de parafina. Con unas pinzas, agarra un borde del soporte del filtro y sumergir en la gota de 10 μl.
    2. Coloque el filtro dentro de la junta tórica. Hacer esto para ambos lados. Con unas pinzas, un filtro de 0,8 μm en el borde del gancho agarrador y sumergir en la gota de 10 μl y capa exterior de la junta tórica con PBS. Coloque el filtro de 0,8 μm suavemente en la junta tórica para que filtro soporta no sobre colgar la membrana interna.
  3. Coloque el bloque de calefacción de extrusora en un plato caliente para precalentar la extrusora. Encender la placa de baja y deje que la extrusora de bloque de calefacción alcanzar la temperatura deseada. Para evitar posibles problemas con la agregación de la proteína, no calentar el bloque pasado 37 ° C.
  4. Cargar la sonicación de la muestra en una de las jeringas extrudadas en la extrusora. Coloque la jeringa de la extrusora en el otro extremo de la extrusora. Asegúrese de que el émbolo de la jeringa vacía se establece en cero. Se llenará la jeringa vacía como el lípido se extruye a través de la membrana de policarbonato 0.8 μm. Trate de evitar pasar burbujas hacia adelante y hacia atrás a través de la membrana.
  5. Coloque la extrusora completamente montada en el bloque calefactor. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa llena con lípidos hacia la jeringa vacía. Dependiendo de la concentración de lípidos, será difícil empujar a través. Repita 20 x.
  6. Retire la extrusora completamente montada el bloque de calefacción. Lentamente retire la jeringa llena del estirador, recoger cualquier lípidos que pueden gotear al retirar. Colocar liposomas en un frasco limpio. Repita los pasos 3.4-3.6 uso policarbonato 0,2 μm y 0,1 μm membranas.
  7. Crear una columna de grano reticulado agarosa 0,7 x 50 cm2 con separación entre 0.7-10 Mega Daltons (MDa) equilibrados en PBS. Añade los liposomas y ejecuta como en el paso 1.6. Fracciones que contienen liposomas habrá disminución de transmisión de luz en el rango de 250-400 nm.
  8. Almacenar los liposomas a 4 ° C y no congelar.

4. calcio flujo para controlar la activación de células B por liposomas antigénicas

  1. Eutanasia a ratones por dióxido de carbono (CO2) o sobredosis de isoflurano, según procedimientos de operación estándar institucionales. Eutanasia de ratones para confirmar la dislocación cervical.
  2. Esterilizar instrumentos quirúrgicos y canal de ratones con etanol al 70%. Uso 10 cm de largo, 0,8 mm punta, curva pinza de iris para separar la piel que cubre la cavidad torácica de la caja torácica. Utilizar 10 cm tijeras de disección largo, recto para hacer una incisión distal con una incisión bilateral.
  3. Utilice el iris curva pinzas y tijeras de disección para extraer el bazo de la cavidad abdominal. Eliminar tejido graso que rodea bazo y colocarla en un tubo cónico de 15 mL poliestireno, llenado de RPMI1640 medio que contiene 1% suero fetal del becerro (FCS) y penicilina-estreptomicina.
  4. Bazo de transferencia y los medios de comunicación sobre un tamiz de 40 μm células montados en un tubo cónico de 50 mL. Utilizando el extremo de la goma de un émbolo de la jeringa de 3 mL, aplastar suavemente el bazo. Lave el filtro de la célula de 40 μm con los medios de comunicación. Repita este proceso hasta que sólo tejido graso queda en el colador de célula 40 μm. Enjuague la criba con 3-5 mL de medio para aumentar la recuperación de la célula.
  5. Centrifugar el homogeneizado celular a 300 x g durante 5 min a TA. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante y añadir 10 mL de tampón de lisis de RBC de x 1 a los pellets. Pipetee hacia arriba y hacia abajo, dejar de 2 a 3 minutos a temperatura ambiente y luego centrifugar a 300 x g durante 5 min a TA.
  6. Deseche el sobrenadante y resuspender esplenocitos glóbulos rojos agotado en 10 mL de medio. Determinar un número total de células usando un hemocitómetro u otro dispositivo de conteo de celdas. Sedimenten las células por centrifugación como se describió anteriormente.
    Nota: La concentración final ideal necesaria para Indo-1 carga de esplenocitos es 10 – 20 x 106 células/mL, pero puede utilizar una menor concentración de células.
  7. Resuspender esplenocitos en 15 x 106 células/mL en el flujo de calcio cargando buffer (medio RPMI1640 que contiene 1% FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES), 1 mM cloruro de magnesio (MgCl2), (1 mM) etilenglicol bis Β-aminoetil éter)-N, N, N', N'-tetraacético, ácido (EGTA) y el 5% penicilina-estreptomicina). Añadir 1,5 μm Indo-1 de una solución stock de 1 mM DMSO, invertir el tubo varias veces para mezclar. Proteger de la luz e incubar las células en baño de agua de 37 ° C durante 30 minutos.
  8. Después de la incubación de 30 min, añadir 5 x la cantidad de flujo de calcio buffer de carga. Centrifugar a 300 x g por 7 min a TA.
  9. Para la sincronización de las células de B, mancha las células con 1: 200 anti-ratón CD5-PE y 1: 200 de anti-ratón B220-PE/Cy7 en 0,5 mL de buffer a 4 ° C por 20 min, protegido de la luz de carga.
  10. Lave esplenocitos en el flujo de calcio carga de buffer y centrifugar a 300 x g por 7 min en RT. resuspender las células en 10 – 20 x 106 células/mL en el flujo de calcio corriente buffer (Hank equilibrada solución de sal (HBSS) que contiene 1% FCS, 1 mM MgCl2 y 1 mM cloruro de calcio (CaCl2)). Almacenar en hielo, protegidos de la luz hasta que esté listo para ejecutar en citómetro de flujo.
  11. Configuración de citometría de flujo con manchas sin manchas y solo controles de compensación.
    1. Funcionamiento de las células para las puertas adecuadamente (ver figura 2A). Configuración de Indo-1 (violeta) versus la trama de la Indo-1 (azul), ajustar las tensiones en los canales de Indo-1 para colocar las células de coloración en una cuesta de 45 a 60 ° para maximizar la señal: ruido de la violeta de Indo-1: cambio azul en proporción después de estimulación de células B.
      Nota: Asegúrese de que las tensiones no son demasiado altas, que un porcentaje significativo de las células (> 5%) son contra la parte superior de la parcela.
    2. Crear una puerta diagonal que encapsula la parte izquierda superior (violeta+azul–) de la parcela, tal que sin estimulación < 10% de las células están en la puerta, que idealmente debería aumentar a > 75% después del estímulo.
  12. Añadir 0,5 mL de células a 5 mL con tubo de poliestireno fondo (celular activado por fluorescencia tubo (FACS) de clasificación) y calentar las células a 37 ° C durante 3 – 5 min en un baño de agua. Coloque el tubo de la FACS en la cámara de agua de 37 ° C conectado a un baño de agua recirculante.
    1. Ejecutar el tubo la water-jacket en el citómetro de flujo e iniciar la adquisición, sin almacenar los datos, a aproximadamente 5.000 – 10.000 eventos/s. Una vez que las células han estabilizado (15-30 s), iniciar la adquisición y recogida de datos para al menos 10 s para establecer el fondo.
    2. En la marca de la s 10, rápidamente Retire el tubo de la citometría de flujo, agregar la estimulación (liposomas antigénica 5-50 mM 2-20 ml), el vórtice de pulso y devolver el tubo FACS en el citómetro de flujo. Mantener la adquisición de datos y almacenamiento de información a través de este tiempo y recopilar datos durante 3 – 5 minutos.
  13. Analizar los datos en el software de análisis apropiado bajo las funciones de la cinética.

5. preparación del extracto de cacahuete

  1. Extracto de proteínas maní mezclando harina de cacahuete en una proporción de 1:5 (wt:vol) de tampón fosfato salino (PBS) con cloruro de sodio de 1 M (NaCl). Mezcle la solución en la placa de agitación magnética durante 2 h a temperatura ambiente manteniendo a pH 8.5.
  2. Solución de centrifugar a 3.000 x g durante 45 minutos a 4 ° C. Decantar y filtro-esterilizar sobrenadante secuencialmente a través de un filtro de 0.4 μm, seguido por un filtro de 0.2 μm. Determinar la concentración de proteína por el análisis de (BCA) ácido bicinchoninic utilizando albúmina sérica bovina (BSA) como estándar.
  3. Reducir y desnaturalizar una muestra de proteínas maní con 50 mM Ditiotreitol (DTT) en un tampón que contiene dodecil sulfato de litio a un pH de 8.4, que permite la máxima actividad del agente de reducción y de calor a 70 º C durante 10 minutos.
  4. Ejecutar 10 μg de proteína desnaturalizada del cacahuete en un gel de poliacrilamida de empaquetados 4 – 12% Bis-Tris diseñado para dar separación óptima gel del gradiente con peso molecular previamente manchada estándar.
  5. Tinción del gel con disulfonated triphenylmethane y desmanchar con ddH2identificar O. conoce los principales alergénicos del cacahuete Ara h 1, 2 y 3 en las preparaciones de extracto. Ara h 1 aparece de 63 kDa, Ara h 2 debe aparecer como dos isoformas en el 17 y 19 kDa, y Ara h 3 aparece en 37 kDa (subunidad ácida).

6. sensibilización de los ratones al cacahuete

  1. Resuspender la toxina del cólera 1 mg en 1 mL de agua ultrapura. Preparar 200 μL diluidas Extracto de cacahuete contiene 2 mg proteína del cacahuete y 10 μg toxina del cólera en PBS.
  2. Administrar 200 μL del extracto de cacahuete contiene cólera toxina (proteína del cacahuete 2 mg y 10 μg toxina del cólera) vía oral por sonda nasogástrica a cada ratón hembra de 4 – 5 semanas viejo BalB/cJ. Repetir una vez por semana durante tres semanas (es decir, en los días 0, 7 y 14).
  3. Administrar 300 μL diluir Extracto de maní (contiene proteína del cacahuete 5 mg y 10 μg toxina del cólera) vía oral por sonda nasogástrica a cada ratón en la cuarta semana (es decir, 21 días).

7. desafío de ratones con el extracto de cacahuete

  1. En el día 28, preparar Extracto de cacahuete a una concentración final de 1 mg/mL en PBS. Medir la temperatura del cuerpo de referencia usando un termómetro rectal (aproximadamente 37,5 a 38,5 ° C). Administrar 200 μl (200 μg) de extracto de maní mediante inyección intraperitoneal (i.p.).
  2. Medir temperatura con termómetro rectal cada 15 min durante 1 h después de la inyección. Un baño en la temperatura corporal indica alergia al cacahuete.
    Nota: La hipotermia es un rasgo distintivo de la anafilaxia en ratones. Este desafío será demostrar que ratones están alérgicos al cacahuete. Típicamente, el 90% de los ratones de Balb/cJ que el protocolo de sensibilización desarrollan reacciones alérgicas durante reto caracterizado por al menos una disminución de temperatura de 2 – 3 ° C.

8. aislamiento de esplenocitos de ratones alérgicos y transferencia adoptiva

  1. Aislar los esplenocitos de ingenuo y ratones alérgicas cacahuetes.
    1. El día 30, eutanasia ingenuo y ratones alérgicas cacahuetes confirmadas mediante la administración de 3 L/min de CO2 en una cámara de gas. Confirmar la eutanasia de los ratones por toracotomía bilateral. Esterilizar instrumentos quirúrgicos y canal de ratón utilizando etanol al 70%. Usar pinzas para separar la piel que cubre la cavidad torácica de la caja torácica. Utilizar tijeras rectas de disección para realizar una incisión bilateral rompiendo las costillas izquierdas y derecha.
    2. Use pinzas y tijeras de disección para extraer el bazo de la cavidad abdominal. Eliminar el tejido graso que rodea el bazo antes de colocar en el tubo cónico de 15 mL poliestireno, con Medio RPMI 1640 de 10 mL.
    3. En una campana de flujo laminar estéril, vierta el bazo y los medios de comunicación en un poliestireno de 35 mm placa de Petri. Mantenga ingenuo y esplenocitos alérgico en distintos platos de Petri y los medios de comunicación durante el aislamiento de células. Use pinzas esterilizadas y tijeras disección bazo en tres pedazos y volver a plato de Petri.
    4. Utilizando el borde áspero, helado de dos portaobjetos de cristal, suavemente homogeneizar (en RPMI) las piezas del bazo hasta tejido blanco permanece entre las diapositivas. Cambio, se desliza entre los grupos.
    5. Transferencia de homogeneizado celular de plato de Petri por un colador de célula μm 70 montada en un tubo cónico de 50 mL. Pasar los fragmentos del bazo a través de la filtro con un émbolo de una jeringa de 1 mL. Enjuague la criba con 5 mL de RPMI para maximizar la recuperación de la célula. Transferir el filtrado a un tubo cónico de poliestireno de 15 mL y centrifugar (450 x g, 10 min, RT).
    6. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celulares en tampón de lisis de eritrocitos de 2 mL (cloruro de amonio de 0,83% en tampón Tris 10 mM, pH 7,2). Mezclar e incubar a temperatura ambiente 2 – 3 minutos agregar 10 mL de PBS - 2% de SBF y centrifugar a 300 x g durante 7 min a TA.
    7. Lavar las células otra vez con 12 mL de PBS - 2% FBS completamente quitar cualquier cloruro de amonio residual y centrifugar a 300 x g por 7 min en RT. resuspender células pellets en 2 mL de Medio RPMI 1640. Contar las células usando un hemocitómetro o analizador automático de Hematología.
  2. Usando un 27 G, aguja de 5/8 de pulgada en una jeringa de insulina 1 mL, inyectar por vía intravenosa 15 x 106 alérgica o ingenuo esplenocitos extraído como se describió anteriormente (en 200 μL) a través de la vena de la cola en ratones ingenuos (intolerancia al Rh-negativo).

9. inyección de ratones con liposomas antigénica de Ara h 2

  1. Preparar el Ah2 liposomas que contienen 0,1% Ah2 a lípidos de 2,5 mM. Para el cálculo de la concentración de proteína, el coeficiente de extinción de Ah2 es 15.000 M-1. Liposomas diluidas a 300 μm en PBS estéril.
  2. Un día después de la transferencia adoptiva (día 31), de alergia o ingenuo esplenocitos, inyectar por vía intravenosa 200 μL de PBS o los liposomas antigénicos Ah2 (300 μm) que contienen un total de 1.38 μg de Ah2 a través de la vena de la cola de ratones BALB/cJ que recibieron los esplenocitos en el paso 8.2.

10. impulso y desafío de ratones con Ara h 2

  1. Dos semanas después de la inyección con Ah2 liposomas, en el día 45, utilice una lanceta de animal de 4 mm para recoger 50 – 200 μL de la sangre de la ensambladura submaxilar del ratón. Recoja la sangre en un tubo separador de suero sin heparina; separado el suero por centrifugación a 6.000 x g durante 15 minutos usar el suero recogido más tarde en anticuerpos de antígenos específicos de medida.
  2. En el día 46, dos semanas después de la inyección a ratones con liposomas (paso 9.2), impulse ratones una inyección i.p. de 200 μL de PBS o 200 μg de Ah2 soluble (purificada como se describió anteriormente16).
  3. En 60 días, recoge 50-200 μL de sangre de la ensambladura submaxilar del ratón y procesar la sangre como se describió anteriormente.
  4. Día 61, desafiar a cada grupo de ratones con una inyección i.p. de 200 μL de 300 μg Ah2 soluble. Medir la temperatura del cuerpo con sonda rectal cada 15 min como en sección 7.

11. cuantificación de Ara h 2-específico IgE e IgG1 por ELISA

  1. Capa un ensayo de 96 pocillos enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA)-placa compatible con 100 μl HSA-DNP (2, 4-dinitrofenilo hapteno conjugado al ser humano de seroalbúmina, 20 μg/mL) para la curva estándar o Ah2 (5 μg/mL) para las muestras de suero recolectaron en pasos 10.1 y 10.3, diluido en de tampón con revestimiento (50 mM de tampón carbonato-bicarbonato, pH 9.6) a 4 ° C durante la noche o 37 ° C durante > 1 h.
  2. Lavar tres veces con 200 μL PBS-T (PBS con 0,05% Tween-20) y bloquear pozos con 200 μL PBS-T que contiene BSA 2% a 37 º C durante > 2 h.
  3. Ah2-específico IgE ELISA, añadir niveles de IgE anti-DNP de 50 μl (2 – 0.002 μg/mL, preparado a partir de diluciones seriadas 1:2) o las muestras de suero de ratón (1:20 dilución) e incubar durante la noche a 4 ° C. Para ELISA de IgG1 específico Ah2, agregar 100 μl purificada normas IgG1 anti-DNP (2 – 0.002 μg/mL, preparado a partir de diluciones seriadas 1:2) o ratón (dilución 1: 500) de las muestras de suero e incubar durante una noche a 4 ° C o 1 h a 37 ° C.
  4. Lavar tres veces con 200 μL PBS-T. Para Ah2-específico IgE ELISA, añada 100 μl ovejas anti-ratón IgE (0,5 μg/mL) e incubar a 37 ° C durante 1 h. Para ELISA de IgG1 específico Ah2, añada 100 μl HRP cabra anti-Mouse IgG1 (diluido 1:40,000 en PBS-T - 2% BSA). Incubar a 37 ° C durante 1 h.
  5. Lavar tres veces con 200 μL PBS-T. Ah2-específico IgE ELISA, añadir 100 ovejas contra burro biotinilado de μl (0,5 μg/mL) de IgG e incuban a 37 ° C por 45 minutos. Para ELISA de IgG1 Ah2-específicos, vaya al paso 11.7.
  6. Lavar tres veces con 200 μL PBS-T. Ah2-específico IgE ELISA, agregar 100 μl neutral cargada avidina-peroxidasa (p. ej., NeutrAvidin-HRP, 0,3 μg/mL) e incube a 37 ° C durante 30 minutos.
  7. Añada 100 μl 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato, incubar 10-15 minutos o hasta que muestras azul oscuro, luego agregar 100 μl parada de TMB. Leer la placa a 450 nm.

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Resultados

Conjugación de la proteína de interés con DSPE-PEG(2000) puede demostrar ejecutando una reducción mostrando un incremento en el peso molecular en comparación con la proteína no conjugada. Figura 1A muestra un gel representante de conjugación de fragmento de anti-ratón IgM F(ab) PEG-DSPE, que muestra un bandshift de 2 – 3 kDa de la proteína desnaturalizada. Tenga en cuenta que aproximadamente el 50% de la proteína parece ser modificado, que se espera que la es...

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Discusión

Los métodos descritos aquí son un protocolo general para la conjugación de una proteína a un lípido que permite la visualización de la proteína en nanopartículas liposómicos. Para proteínas de multi-subunidades muy grandes, este protocolo puede haber limitado utilidad. El método ideal sería la introducción de una etiqueta específica que permite una estrategia de enlace químico biorthogonal ser utilizado. Si expresan la proteína por vía recombinante, esto puede ser posible utilizando estrategias específicas disponibles

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por becas del Departamento de defensa (W81XWH-16-1-0302 y W81XWH-16-1-0303).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Modelo 2110 Colector de fraccionesBioRad7318122
CholestrolSigmaC8667Sigma grado 99%
SPDPThermo Fisher Scientific21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimidaAvanti 880126
ExtrusoraAvanti610000Jeringa de 1 mL con soporte/bloque calefactor
Filtros 0.1 y micro; mAvanti610005
Filtros 0.8 µ mAvanti610009
10 mm Soportes de filtroAvanti6100014
Vidrio Matraz de fondo redondoSigmaZ100633
Tapones de rotaciónThermo Fisher ScientificP-301398
TuboThermo Fisher ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Sephadex G50 BeadsGE Life Sciences17004201
Sephadex G100 BeadsGE Life Sciences17006001
Heat Inactivated Fetal Calf SerumThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
1x tampón de lisis RBCThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112sin calcio y magnesio
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab anti-ratón IgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 anti-ratón IgMJackson ImmunoResearch115-006-020
Harina de cacahueteGolden Peanut Co.52127112% grasa tueste ligero, 50% proteína
Agujas de alimentación animalCadence Science792022g x 1.5", 1.25 mm - recto
Termómetro de microsondaPhysitempBAT-12
Sonda rectal para ratonesPhysitempRet-3
Toxina del cólera, de Vibrio choleraList Biological Laboratories, Inc.100BKit de ensayo de
proteínas BCAPierce23225
Tampón de carbonato-bicarbonatoSigmaC3041
TMB Solución de paradaKPL50-85-06
SureBlue TMB Microwell Sustrato de peroxidasaKPL5120-0077
96 pocillos, placa Immulon 4HBX ThermoScientific3855
Ara h 2N/AN/Apurificado como en: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Mouse IgE anti-DNPAccurate ChemicalBYA60251
Sheep anti-Mouse IgEEl sitio de uniónPC284
Biotinilado Burro anti-ovejas IgG PrecisoQuímico
NeutrAvidin Protein, HRPThermoFisher Scientific31001
Ratón IgG1 anti-DNPPrecisoMADNP105 Químico
HRP Cabra anti-ratón IgG1 SouthernBiotech1070-05
mL Jeringas de InsulinaBD 329412U-100 Insulina, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")
Superfrost Portaobjetos de MicroscopioFisher Scientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1.0 mm
ACK Lysing Buffergibco by Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific 11875093500 mL
Filtro de célulasCorning35235070 μ m Nylon, Blanco, Estéril, Empaquetado individualmente
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsInvitrogenNP0322BOX 10 geles
Tampón NuPAGE LDS, 4xInvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-teñido estándarInvitrogenLC5925500 µ L
Tampón de funcionamiento NuPAGE MES/SDS, 20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode BlueStain Thermo Scientific24590500 mL
sin azida JNS065003 1

Referencias

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

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