Aquí, presentamos un protocolo de tuberculosis humana modelo en un pez cebra adulto utilizando su patógeno natural marinum de la micobacteria. Extraen ADN y ARN de los órganos internos del pez cebra infectado pueden utilizarse para revelar que el total de micobacterias cargas en los peces y la respuesta inmune del hospedador con qPCR.
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Artículo de método
Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto
En este artículo
Resumen
Resumen
Mycobacterium tuberculosis es actualmente el patógeno humano más mortal causando infecciones 10,4 millones y 1,7 millones de muertes cada año. La exposición a esta bacteria causa un espectro amplio de enfermedad en los seres humanos que van desde una infección esterilizada a una mortal enfermedad activa progresiva. La forma más común es la tuberculosis latente, que es asintomática, pero tiene el potencial de reactivar en una enfermedad fulminante. Pez cebra adulto y su patógeno natural marinum de la micobacteria han demostrado recientemente para ser un modelo aplicable para estudiar el espectro amplio de enfermedad de la tuberculosis. Lo importante, se puede estudiar espontánea latencia y reactivación así como respuestas inmune adaptativas en el contexto de infección por micobacterias en este modelo. En este artículo, se describen métodos para la infección experimental del pez cebra adulto, la colección de órganos internos para la extracción de ácidos nucleicos para la medición de cargas de micobacterias y anfitrión inmunorespuestas por PCR cuantitativa. El en desarrollada internamente, M. marinum -ensayo qPCR específica es más sensible que los métodos tradicionales de la galjanoplastia como también detecta DNA de micobacterias no se dividen, latentes o recientemente muertas. Como ADN y ARN extraídos de la misma persona, es posible estudiar las relaciones entre el estado enfermo y la expresión de genes huésped y patógeno. El modelo de pez cebra adulto para la tuberculosis se presenta así como un sistema altamente aplicable, no mamíferos en vivo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno.
Introducción
Pez cebra (Danio rerio) es un modelo animal ampliamente utilizado en la investigación biomédica y es un modelo aceptado para la biología de vertebrados comun. El pez cebra se ha adaptado a muchos campos de investigación modelado de enfermedades humanas y trastornos que van desde cáncer1 y2 de la enfermedad cardiaca infección y estudios inmunológicos de varias bacterias 3 y las infecciones virales4 , 5. Además, el desarrollo de ex útero de embriones de pez cebra ha hecho el pez cebra un modelo popular en Biología del desar....
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Protocolo
Pez cebra todos los experimentos han sido aprobados por la Junta de experimento Animal en Finlandia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Métodos se realizan según la ley (497/2013) y el decreto del gobierno (564/2013) sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos o educativos en Finlandia.
1. cultivo de Micobacterium marinum
Nota: Desde marinum de la micobacteria es un patógeno capaz de causar infecciones superficiales en los seres humanos, encontrar las orientaciones locales para la seguridad personal y la eliminación de residuos de riesgo biológico antes de comenzar a trabajar con esta bac....
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Resultados
El patógeno natural de pescado marinum de la micobacteria infecta los órganos internos del pez cebra y produce una infección sistémica con granulomas histológicamente visible19. Pez cebra adulto están infectadas con M. marinum por inyección intraperitoneal. Se extracción el ADN y el ARN, y la carga por micobacterias se mide por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) usando la DNA como plantilla. El esquema del método se muestra.......
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Discusión
Aquí describimos una aplicación basada en qPCR para medir cargas micobacterias de ADN extraído de los tejidos del pez cebra adulto infectados experimentalmente. Esta aplicación se basa en cartillas diseñadas alrededor de la 16S-23S rRNA espaciador transcrito interno secuencia40. La carga total de micobacterias en una muestra de pescado se calcula usando una curva estándar, preparada a partir de ADN extraído de un número conocido de micobacterias cultivadas y suponiendo que una bacteria tiene una c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por el finlandés Cultural Foundation (H.L.), Tampere Tuberculosis Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Fundación de la Asociación contra la Tuberculosis finlandesa (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid frescos Juselius Fundación (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane y Aatos Erkko Fundación (M.P.) y Academia de Finlandia (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo y Jenna Ilomäki son reconocidos por su asistencia técnica. Los autores reconocen el laboratorio de pez cebra de Tampere para su servicio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enriquecimiento | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medio | BD, Thermo Fisher Scientific 11753473 | ||
| Middlebrock ADC enriquecimiento | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Espectrofotómetro | Thermo Fisher Scientific | ||
| Tabletas salinas tamponadas con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Rojo de fenol | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Aguja de 27 G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| Jeringa de 1 mL | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30 G aguja de insulina | Braun | 9151133 | |
| Éster etílico de ácido 3-aminobenzoico (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1,5 mL tubo de homogeneización | Qiagen | 13119-1000 | |
| Perlas de cerámica de 2,8 mm | Qiagen | 13114-325 | |
| Etanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Cloroformo | VWR | 22711.290 | |
| Tiocianato de guanidina | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118,2 g/mol |
| Citrato | de sodioSigma-Aldrich | 1613859 | FW 294,1 g/mol |
| Tris (base libre) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121,14 g/mol |
| Reactivo TRI | Centro de Investigación Molecular | TR118 | Solución de tiocianato-fenol de guanidina |
| Homogeneizador PowerLyzer24 | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Mezcla Maestra Verde | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR Placa de 96 pocillos | BioRad | HSP9601 | |
| Película ópticamente transparente | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Termociclador con sistema en tiempo real CFX96 | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | reactivo de descontaminación que elimina las RNasas |
| DNasa I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Transcripción inversa Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
Referencias
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80(2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S.
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Reimpresiones y permisos
