Artículo de método

Aislamiento y la descelularización de un páncreas todo porcino

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DOI:

10.3791/58302

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10 de octubre de 2018

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1Department of Surgery, Institute of Clinical Sciences, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 2The Transplant Institute, Sahlgrenska University Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Ingeniería de tejidos del páncreas entero es un desafío debido a sus funciones exocrinas y endocrinas. Mostramos un método para la disección de un páncreas porcino intacto y el proceso de éxito descelularización por perfusión de detergentes Triton X-100, desoxicolato de sodio y desoxirribonucleasa.

Resumen

Ingeniería de tejidos del páncreas entero puede mejorar los tratamientos actuales para la diabetes mellitus. El objetivo final es páncreas Ingeniero de tejido de un origen alogénico o xenogeneicos con células humanas. Una demostración de los métodos de disección eficiente, descelularización y recelularización de páncreas porcino podría beneficiar el campo. Similar al páncreas humanos, páncreas porcinos tienen un arreglo anatómico especial con tres lóbulos (esplénica, duodenal y conexión) rodeada por el duodeno y el intestino. El lóbulo duodenal del páncreas se conecta con el duodeno por varios vasos sanguíneos. Ingeniería de tejidos del páncreas es complicada debido a su naturaleza exocrina y endocrina. En este documento, se muestra un protocolo detallado para disecar el páncreas entero porcino y decellularize con detergentes ahorrando en su estructura y algunos componentes de la matriz extracelular. Para lograr el total de la perfusión, la aorta es elegida como entrada y la salida de la vena porta. Se unen los otros vasos sanguíneos (arteria hepática, vena esplénica, arteria esplénica, árbol de la arteria y vena mesentérico) y conducto biliar. Para evitar la formación de trombo, el cerdo es heparinizado y, inmediatamente después de la disección, se lava el órgano con heparina frío. Para inhibir la acción de enzimas exocrinas, la descelularización de páncreas se encuentra a 4 º C. La descelularización se realiza por perfusión de Tritón X-100, desoxicolato de sodio y desoxirribonucleasa, con un intermitente y final lavado extenso. Con un éxito descelularización, páncreas aparece blanco, y una evaluación histológica con hematoxilina y eosina muestra una ausencia de núcleos con una estructura de matriz extracelular conservado. Así, el método propuesto puede utilizarse con éxito diseccionar y decellularize Páncreas porcino todo.

Introducción

Diabetes mellitus se caracteriza por la presencia de niveles elevados de glucosa en sangre. Es reconocido como un reto de salud pública importante en la mayoría de países1. Altos niveles de glucosa en la sangre afectan los vasos sanguíneos y sistema nervioso, causando daño a los ojos, el corazón y los riñones y la isquemia de la extremidad. Los métodos tradicionales de tratamiento son las inyecciones de insulina exógena, fármacos y cambios de estilo de vida. Dejando a un lado una cura para la enfermedad, en algunos casos, los tratamientos disponibles no mantener la insulina a niveles terapéuticos, dando por resultado hiperglucemia. Aunque el trasplante de islotes o páncreas entero elimina la enfermedad, no está comúnmente hecho debido a la escasez de órganos de donante conveniente y debido a los riesgos y dificultades de la immunosupresión y encapsulación2.

Mejoras actuales en el campo de la medicina regenerativa e Ingeniería del tejido poseen la capacidad para proporcionar una solución para estos problemas. Con la técnica de descelularización, el material celular de un donante humano o animal puede ser retirado mientras las proteínas importante matriz extracelular (MEC), factores de crecimiento, y moléculas de señalización se conservan en el andamio. Estos andamios potencialmente pueden ser transplantados sin necesidad de inmunosupresión, a restaurar la función del órgano después de recelularización con el no inmunogénica células3,4 del destinatario. Los órganos tejido-dirigida fuentes alogénico o xenogeneicos pueden utilizarse en el trasplante de la clínico, como las proteínas de matriz extracelular importante se conservan entre especies y no pueden ser rechazadas después de trasplante5.

Descelularización es un método bien explorado que implica el uso óptimo de las fuerzas físicas, detergentes químicos y enzimas en un ambiente fisiológico para eliminar material nuclear y las células de un tejido u órgano. Recelularización es un procedimiento de siembra de células en el órgano acelular. Es un procedimiento intelectualmente difícil, que requieren un gran número de células, una estrategia óptima de siembra de células y un sistema de biorreactor para el cultivo de órganos en condiciones fisiológicamente aceptables como temperatura, presión y gases6.

El páncreas puede considerarse un tejido un reto para la ingeniería de tejidos debido a su capacidad exocrina y endocrina. El tejido exocrino segrega varias enzimas digestivas, mientras que la parte endocrina secreta hormonas, incluyendo insulina. La descelularización de páncreas intactos de ratón7,8, humana9y cerdo10 ya ha sido reportado con enzimas (tripsina, desoxirribonucleasa recombinante [ADNasa]) y no iónicos (Triton X-100) y detergentes iónicos () El desoxicolato del sodio [SDC] y dodecil sulfato de sodio [SDS]). Sin embargo, siguiendo los protocolos publicados, luchábamos con disección exitosa y completa perfusión descelularización manteniendo una estructura de la ECM. Especulamos que los detergentes aplicados durante la descelularización causan lisis de las células, de tal modo liberando enzimas digestivas en el órgano. Las enzimas liberadas causará un daño irreversible al andamio de ECM y hacer ineficiente de descelularización y recelularización. Un diseño del método que efectivamente decellularizes páncreas mientras que inhibe la acción de las enzimas digestivas puede solucionar el problema. Elegimos la estrategia de Peloso et al., de la descelularización de páncreas a temperaturas frías, aunque no informó sobre por qué frío es usado9. Al mismo tiempo, hemos diseñado una estrategia de disección con modificaciones de Taylor et al. eligiendo la aorta como una entrada de la perfusión por la Arteria celíaca (CT) y la arteria mesentérica superior (SMA)11.

En un artículo recientemente publicado12, nos muestran un método para el aislamiento eficaz y la descelularización de páncreas porcino conservando algunos componentes de la ECM. En este trabajo, mostrar una descripción detallada de cómo diseccionar un páncreas todo porcino que contiene esplénico, duodenal y lóbulos de conexión y presentar un protocolo progresivo de descelularización exitosa.

Protocolo

La disección de un páncreas porcino y el procedimiento de descelularización presentado aquí seguir las normas éticas de la Universidad de Gotemburgo.

1. preparación de la configuración de descelularización

  1. Usando tubos de silicona de 3 x 5 mm, conectar en serie el envase de detergente de la entrada a la bomba de peristalic y luego al páncreas en el órgano de cámara vía el desgaseador (ver figura 1). Conecte un luer macho en el extremo libre del tubo en la cámara de órgano.
  2. Usando otro tubo de silicona 3 x 5 mm, conecte la cámara de órgano la salida detergente envase a través de la bomba peristáltica para recoger el detergente perfundido.
  3. Conecte una pipeta de 2 ml sin etiquetar a los extremos libres de los tubos de entrada detergente envase y detergente cointainer de salida.
  4. Mantener el montaje entero a 4 ° C.

figure-protocol-1
Figura 1: preparación de la configuración de perfusión. Utilizando un tubo de silicona 3 x 5 mm, como se muestra en la configuración, se conectan en serie el envase de detergente de la entrada a la bomba peristáltica, el desgasificador y la cámara de órgano. Las flechas negras indican la dirección del flujo del contenedor de detergente de la entrada a la cámara de órgano. Para la toma de detergente, otro tubo de silicona 3 x 5 mm y conecte el órgano cámara a través de la bomba peristáltica en el contenedor de detergente corriente. Las flechas rojas muestran la dirección del flujo de la cámara de órgano al contenedor de detergente corriente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. preparación de soluciones de descelularización

  1. Solución 1 (tampón fosfato salino [PBS]): Añadir 8 g de cloruro de sodio (137 mM), 0.2 g de cloruro de potasio (2,7 mM), 1,44 g de fosfato de sodio (10 mM) y 0.24 g de fosfato de potasio (1,8 mM) a 1 L de agua ultrapura y revuelva hasta que se disuelva. Ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico (HCl). En total, 3,2 L de esta solución es necesaria.
  2. Solución 2 (PBS + heparina): para 1 L de solución 1, añadir 3,4 mL de heparina (17 unidades internacionales [UI] /mL). Preparar esta solución fresca y mantenerlo en hielo hasta que esté frío. En total, 1,2 L de esta solución es necesaria.
  3. Solución 3 (agua ultrapura, azida sódica + disódico ácido etilendiaminotetraacético [EDTA]): hasta 1 L de agua ultrapura, añadir 1,86 g de EDTA (5 mM) y 200 mg de azida de sodio (0,02%). Revolver hasta que se disuelven las sales. Enfriar la solución a 4 ° C antes de usar. En total, 22 L de esta solución es necesaria.
  4. Solución 4 (PBS + azida de sodio EDTA): para 1 L de solución 1, agregar 200 mg de azida de sodio (0,02%) y 1,86 g de EDTA (5 mM). Revolver hasta que se disuelven las sales. Enfriar la solución a 4 ° C antes de usar. En total, se necesita 1 L de esta solución.
  5. Solución 5 (agua ultrapura + azida sódica): para 1 L de agua ultrapura, agregar 200 mg de azida de sodio (0,02%). Revolver hasta que se disuelven las sales. Enfriar la solución a 4 ° C antes de usar. En total, 260 L de esta solución es necesaria.
    Nota: El EDTA forma un precipitado con COSUDE y fue excluido de la solución 5 se utilizará para el lavado inmediato antes y después del tratamiento del SDC.
  6. Solución 6 (COSUDE + Triton X-100): A 940 mL de agua ultrapura, añadir 40 g (4%) COSUDE, 60 mL (6%) Triton X-100, 200 mg de azida de sodio (0,02%) y 69,6 mg de fluoruro de phenylmethylsulfonyl (0,4 mM) (PMSF). Revuelva hasta que se disuelva. Enfriar la solución a 4 ° C antes de usar. Añadir PMSF antes de su uso. En total, se necesita 9,6 L de esta solución.
  7. Solución 7 (DNasa): Unidades añadir 10.000 Kunitz de DNasa-I en 250 mL de PBS de Dulbecco (Kunitz 40 unidades/mL) que contiene CaCl2 y MgCl2. Preparar fresco y utilizar inmediatamente. Caliente la solución a 37 ° C antes de usar.
  8. Solución 8 (PBS + sodio azida): para 1 L de solución 1, agregar 200 mg de azida de sodio (0,02%). Revolver hasta que se disuelven las sales. Enfriar la solución a 4 ° C antes de usar. En total, se necesita 1 L de esta solución.

3. disección del páncreas porcino

Nota: En este estudio, páncreas porcinos fueron disecados de eutanasia, cerdos hembra heparinizada (400 UI/kg) peso de 45 kg de una granja.

  1. Coloque el cerdo en la mesa de disección en la posición supina.
  2. Haga una incisión del midline del proceso xiphoidal al hueso púbico (aproximadamente 40 cm) con un bisturí, exponiendo todos los órganos abdominales.
  3. Localizar el bazo, duodeno y lóbulos de la conexión.
  4. Localizar el nivel de la papila duodenal mayor y ligar el duodeno por vía oral desde ese sitio mediante dos suturas separadas.
  5. Ligar el esófago inferior con dos suturas separadas y cortadas entre las ligaduras con las tijeras para sacar el estómago.
  6. Separar el tejido conectivo de los dos puntos para llegar al intestino delgado.
  7. Separar el tejido conectivo de los dos puntos que une al esplénico lóbulo del páncreas.
  8. Quitar el colon desde el intestino después de la ligadura de las arterias.
  9. La vena mesentérica inferior y el árbol de la arteria mesentérica inferior y la ligan con una sutura donde aparecen caudalmente del páncreas.
  10. Ligar la arteria esplénica y la vena junto con una sutura, cerca del bazo, en el hilum y distalmente con unas tijeras para extirpar el bazo.
  11. Siga el duodeno hasta los lóbulos duodenales y la conexión están habilitados y ligan el duodeno al final con dos suturas separadas.
  12. Disecar la vena porta, ligan con una sutura para prevenir cualquier fuga de sangre desde el hígado y corte proximal a la ligadura. La vena porta es una toma de corriente durante la descelularización.
  13. Disecar y ligar el conducto colédoco y la arteria hepática con dos suturas. Corte distal a las suturas.
  14. Encontrar la aorta con la vena renal y disecar en dirección craneal del músculo y del tejido conectivo hasta llegar a la zona pancreática.
  15. Voltee el páncreas suavemente y disecar la aorta, manteniendo intacto, la SMA y la CT y cortar la aorta superior a TC y inferior a SMA con tijeras.
  16. Cortar el resto de los tejidos circundantes con unas tijeras y extraer el páncreas.
  17. Utilizando una jeringa de 50 mL conectada a la cánula de 4 mm arteriotomía, lave el órgano a través de la aorta con solución 2 hasta perfuses el órgano entero o hasta que el órgano entero se convierte en frío.

4. preparación del páncreas porcino de descelularización

  1. Mantener el páncreas a 4 ° C o en hielo durante todo el proceso.
  2. Cortar las suturas del duodeno utilizando tijeras, limpiarlo de alimentos lavándolas 50-150 mL de agua ultrapura mediante una pipeta de 25 mL y ligar otra vez con suturas.
  3. Ligar un extremo de la aorta y todas las ramas además de la SMA y el CT con suturas para evitar fugas.
  4. Insertar desde el otro extremo de la aorta una cánula de 4 mm arteriotomía y ligan con suturas.
  5. Perfusión del páncreas con solución de 3 por 1 h a 20 mL/min utilizando el montaje de descelularización.
    Nota: Rellenar previamente los tubos de la bomba con la solución 3 tales que ningunas burbujas entre el páncreas. Busque cualquier fugas de todas las partes del órgano y ligar las ramas vasculares abiertos con suturas, excepto la vena porta.
  6. Congelar el páncreas a-20 ° C en solución 4 hasta el comienzo de la descelularización.

5. descelularización de páncreas porcino

  1. Descongelar el páncreas a 4 ° C.
  2. Funcionar la bomba peristáltica en la instalación de descelularización con solución de 3 a 20 mL/min hasta que no se ven burbujas de aire en el tubo de entrada de detergente.
  3. Coloque el páncreas en el recipiente de descelularización y conecte el tubo de entrada de detergente a la aorta del páncreas. Lavar el órgano por perfusión con solución 3 noche en 20 mL/min a 4 ° C.
  4. Vierta la solución en la cámara de órgano.
  5. Reemplazar la solución 3 con solución 5 y perfusión del páncreas durante 30 min a 20 mL/min a 4 ° C. Vierta la solución en la cámara de órgano.
  6. Añadir solución 6 y perfusión del páncreas de 8 h a 20 mL/min a 4 ° C. Vierta la solución en la cámara de órgano.
  7. Lavar el órgano por perfusión con solución 5 durante 96 h a 20 mL/min a 4 ° C. Vierta la solución en la cámara de órgano.
  8. Preparar el páncreas para el tratamiento de DNasa por recirculación 500 mL de PBS de Dulbecco con CaCl2 y MgCl2 durante 30 min a 37 ° C. Vierta la solución en la cámara de órgano.
  9. Añadir 250 mL de solución 7 y perfusión del páncreas durante 4 horas a 20 mL/min a 37 ° C. Vierta la solución en la cámara de órgano.
  10. Lavar el órgano por perfusión con solución 5 h 120 a 20 mL/min a 4 ° C.
  11. Guarde el órgano en solución 8 a 4 ° C por períodos cortos o a-20 ° C durante largos periodos.

6. verificación de descelularización

  1. Con unas tijeras, corte de biopsias de 3 a 10 mm de todos los lóbulos del páncreas y fijar en formol durante 48 h a temperatura ambiente.
  2. Lave las piezas en agua ultrapura durante 15 min, procesarlos en un procesador de tejidos siguiendo protocolos estándar e incrustarlos en parafina.
  3. Cortar secciones de 5 μm con micrótomo y mancha por hematoxilina y 0.2% alcohólica eosina Meyer (HE) siguiendo protocolos estándar.
  4. Ver las diapositivas microscopio óptico para comprobar la pérdida de núcleos.
    Nota: Una pieza de un tejido fresco procesado en la misma forma puede utilizarse como un control para verificar la presencia de núcleos.

Resultados

Imágenes de disección representante de páncreas porcino, que pueden ayudar en la localización y disección de la arteria mesentérica inferior y vena el árbol, la vena porta, la arteria hepática, el conducto biliar y la aorta que se ramifica a CT y SMA, se muestran en la figura 2A, 2By 2C (amarillo flechas), respectivamente. Figura 3A muestra la morfología gruesa de un páncreas normal, que aparece luz rosa y contiene esplénico, conexión y lóbulos duodenales. Después de descelularización, el color rosa se ha perdido y el páncreas decellularized parece blanco pálido en color. La imagen de morfología bruto mostrando esplénico, conexión y lóbulos duodenales de un páncreas decellularized se muestra en la figura 3B. Figura 3 muestra la presencia de muchos núcleos azul en un páncreas normal por la coloración con él. En un páncreas decellularized, el HE de tinción demostró una pérdida de núcleos, como no ven núcleos azul (figura 3D).

figure-results-1
Figura 2: imágenes de una disección del páncreas porcino. (A) Ubicación del inferior mesentérica arteria y vena árbol (flecha amarilla). (B) la ligadura de la vena porta, la arteria hepática y conducto biliar (flecha amarilla). Aorta (C) ramificación de la Arteria celíaca y de la arteria mesentérica superior (flecha amarilla). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: bruto morfología y coloración de páncreas normales y decellularized. (A) bruto morfología de un páncreas normal. (B) morfología gruesa de un páncreas decellularized. (C) la coloración indica la existencia de núcleos azul en un páncreas normal. Tinción (D) muestra la ausencia de núcleos azul en un páncreas decellularized. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo propuesto, mediante perfusión de COSUDE y Triton X-100 a 4 ° C, decellularize todo porcino páncreas con éxito. El desafío en esta técnica es la disección del páncreas intacta que contiene los tres lóbulos sin dañar el parénquima y sus buques suministros, así como la ligadura de las otras ramas vasculares del espécimen para la perfusión del órgano sin salida. El páncreas porcino tiene una anatomía diferente en comparación con el páncreas humano. Consta de tres lóbulos y permanece en estrecho contacto con el intestino delgado por la parte que lo rodea. Diseccionamos el duodeno junto con el páncreas, como varios vasos sanguíneos de páncreas conectar el intestino. Durante los estudios de optimización, corte embotado de estos vasos sanguíneos ha demostrado la salida y una incompleta perfusión de soluciones.

Ya que la aorta se conecta con el páncreas a través de las arterias mesentéricas superiores y celíacos, elegimos la aorta como una entrada para la perfusión sencilla solo utilizando una cánula y, por tanto, una entrada. En nuestra experiencia, la ligadura de la aorta por encima del CT y por debajo de la SMA reducirá el tiempo de la disección y reduce el riesgo de dañar alguno de los dos vasos. Además de un cerdo heparinizado, también notamos que una perfusión de heparina frío a través de la aorta inmediatamente después de la disección ayuda en la realización de la perfusión de soluciones en todo el órgano. Especulamos que si esto se produce al evitar la formación de coágulos de sangre en los vasos sanguíneos. La perfusión inicial de un páncreas con agua ultrapura después de la disección se Lisan glóbulos rojos y eliminar los restos de sangre en el órgano, impidiendo la formación de coágulos de sangre. Este período también puede utilizarse para encontrar cualquier unligated pequeñas ramas de venas y arterias, como flujo de sangre se puede notar fácilmente sobre el fondo.

Optamos por mantener el procedimiento de descelularización todo en frío (4 ° C), como esto obstaculizará la acción de enzimas exocrinas que liberan de las células exocrinas del páncreas. Las enzimas exocrinas, cuando no se inhibe, pueden causar un efecto deletéreo sobre las células y la MEC, como que pueden digerir las membranas celulares y proteínas12. Como la congelación y descongelación pueden explotar eficazmente las células y se incluyeron un paso de congelación/descongelación, inicialmente incluso antes de la perfusión de detergentes4,13. El lavado inicial después de descongelar elimina los restos de la célula estalla. El tratamiento detergente que utilizamos es una mezcla de COSUDE y Triton X-100 en concentraciones inusualmente altas y a una velocidad de perfusión alta. Elegimos este enfoque para lograr más rápido descelularización mediante la eliminación de las células exocrinas que dañar el ECM. Especulamos que un protocolo rápido y duro es beneficioso de descelularización de páncreas, como menos tiempo estará disponible para las enzimas pancreáticas interactuar con el ECM, preservando así buenos componentes de ECM. Para preservar los componentes de la ECM, también hemos añadido inhibidor de la proteasa de serina (PMSF) a las soluciones de detergente, ya inhiben la activación de enzimas liberadas desde las células exocrinas14. Azida de sodio se agrega a todas las soluciones de descelularización, ya que actúa como un agente bacteriostático, inhibiendo la posibilidad de contaminación bacteriana15.

El páncreas decellularized siguiendo este protocolo demostrada una preservación de las estructuras de la ECM y el ECM proteínas colágeno y elastina. Sin embargo, una pérdida significativa de glicosaminoglicanos fue notada en el páncreas decellularized. El páncreas decellularized de esta manera también demostrada la promesa para el accesorio de células madre de páncreas fetales humanos y la expresión de marcadores exocrinas y endocrinas en piezas recellularized para 14 días12. Sin embargo, para generar un páncreas intacto y funcional, se requiere investigación adicional en la evaluación de celular correcto fuentes, tipos de la célula, célula siembra estrategias y cultura biorreactor.

Divulgaciones

S.S.H. posee acciones en Verigraft, una empresa que ha licenciado la tecnología de la ingeniería del tejido fino vascular. Otros autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por una subvención del gobierno LUA ALF sueco a la S.S.H.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cánula de arteriotomía DLP de 4 mmMedtronic31104
2ml Pipeta sin etiquetarvWR612-3720
DegasserBiotech AB0001-6484
DNase-IWorthingtonLS0020007
PBS de Dulbecco con CaCl2 y MgCl2Sigma AldrichD8662
Sal disódica EDTA dihidratadaAlfaAesarA15161. Heparina OB
Leo 387107
Luer Macho con 1/8" ID BarbOinaLM-2PP-QCPara tubo de silicona de 3X5mm
Bomba peristálticaOinaSP-1X4
PMSFRoche10837091001Inestable en solución acuosa. Debe añadirse fresco antes de la perfusión.
Cloruro de potasioSigma AldrichP5405
Hidrogenofosfato de potasioSigma AldrichP9791
SDCSigma Aldrich30970
Tubo de silicio 3X5mmVWR2280706
Azida de sodioSigma Aldrich71290
Cloruro de sodioSigma Aldrich13423
Hidrogenofosfato de sodioMerck71640-M
SuturaVö mel14817
Jeringa 50mLBecton Dickinson300137
Triton-X-100AlfaAesarA16046. De

Referencias

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