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Artículo de método

Detección y aislamiento de cuerpos apoptóticos de alta pureza

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DOI:

10.3791/58317

⸱

12 de agosto de 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Genetics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

En este artículo

Resumen

Un flujo de trabajo mediante centrifugación de flujo cytometry o diferencial se desarrolla para detectar, cuantificar y aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de apoptotic de alta pureza.

Resumen

Cuerpos apoptóticos (ApoBDs), microvesículas y exosomas son los miembros clave de la familia de vesículas extracelulares, con ApoBDs siendo uno del tipo más grande. Se ha propuesto que puede ayudar a ApoBDs celular separación así como la comunicación intercelular a través de biomoléculas de la trata de personas. Enfoques convencionales para la identificación y aislamiento de ApoBDs a menudo están limitados por la falta de cuantificación precisa y muestra baja pureza. Aquí, describimos un flujo de trabajo para confirmar la inducción de apoptosis, validar la formación ApoBD y aislar ApoBDs de alta pureza. También esbozar y comparar celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación y centrifugación diferencial basado en enfoques para aislar ApoBDs. Además, la pureza de ApoBDs aislados se confirmará mediante una previamente establecer flujo cytometry basado en coloración y método analítico. Tomados en conjunto, utilizando el enfoque descrito, THP-1 Desmontaje de monocitos apoptotic y la apoptosis celular fue inducida y validado, y ApoBD generado a partir de monocitos THP-1 fueron aisladas a una pureza de 97-99%.

Introducción

Apoptosis, una forma bien estudiada de muerte celular programada, es necesaria para mantener la homeostasis fisiológica y eliminar células potencialmente dañinas en el cuerpo humano1. Después de la inducción de la apoptosis, las células apoptotic (ApoCells) pueden someterse a una serie de cambios morfológicos y desmontar en pequeñas vesículas de membrana denominadas ApoBDs. En general, este proceso se conoce como desmontaje de la célula apoptótica y puede dividirse en 3 pasos distintos basados en morfología2,3. Paso 1 (membrana del plasma blebbing) se caracteriza por la formación de globo-como las estructuras en la superficie de la célula conocido como ampollas4,5. Paso 2 (formación de protusión apoptóticos) incluye la formación de protrusiones de membrana larga como apoptopodia, apoptopodia de cuentas y microtúbulos picos6,7,8. Por último, el paso 3 (formación ApoBD) incluye la fragmentación de la apoptosis protuberancias o ApoCells para generar ApoBDs6,9. Los resultados anteriores han sugerido un papel de ApoBDs en ayudar a la separación de células apoptotic y mediar la comunicación intercelular. Por ejemplo, se propone que la fragmentación de un ApoCell en ApoBDs puede generar pequeñas cantidades de 'pequeñas' que podrían eliminarse fácilmente rodeando los fagocitos2,10,11. Además, ApoBDs puede albergar una serie de biomoléculas como el DNA, RNA y proteínas, que pueden ser víctimas de la trata a las células circundantes para facilitar la comunicación de célula12,13,14. Para funcionalmente investigar estos procesos, es vital para confirmar tres parámetros fundamentales, incluyendo (i) validación de inducción de apoptosis y la formación de ApoBD, (ii) aislamiento de ApoBDs y (iii) confirmación de pureza ApoBD.

Previamente, una serie de métodos como citometría de flujo y microscopia electrónica se ha utilizado para estudiar la apoptosis y ApoBDs15,16,17,18. Sin embargo, cuantificación y detección de ApoBD son a menudo difíciles o se pasa por alto. Por ejemplo, la apoptosis basados en citometría de flujo del utilizan más habitualmente análisis emplea anexina V (A5, una proteína que se une el externalizados ' comer-me' señal fosfatidilserina (PtdSer)) y ácidos nucleicos de la mancha (PI) el yoduro de propidio19. Sin embargo, mediante el uso de esta combinación de tinte universal, análisis asume que hay solamente tres tipos de subconjuntos de la célula (células viables, ApoCells y células necróticas) en la muestra. Además, aunque se considera como "estándar de oro" por muchos investigadores para apoptosis, ensayos de citometría de flujo y análisis de datos posteriores a menudo excluyen ApoBDs a través de un primer paso bloquea seleccionar eventos deintermedio-alto FSC/SSC. Por ello, recientemente hemos desarrollado un análisis de citometría de flujo novela con A5 y PRO-TO-3, otra mancha nucleico que puede ser selectivamente tomada por caspasas 3/7-activa pannexin 1 (PANX1) canales7,20. Como la activación de caspasas inducida por 3 PANX1 precede PtdSer exposición en la etapa temprana de la apoptosis, TO-PRO-3 manchas diferencialmente apoptotic y células necróticas. Además, este acercamiento combinado con nuestra novela gating estrategia incluye eventos todos adquiridos durante el análisis de datos y como resultado, se identifican seis subconjuntos de la célula/de la partícula, incluyendo: (i) las células viables (FSC/SSCintermedio/alto, A5bajo , TO-PRO-3bajo), (ii) A5– ApoCells temprano (FSC/SSCintermedio/alto, A5bajo,intermedioPRO-TO-3), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta , TO-PRO-3intermedia), células necróticas (iv) o ApoCells finales (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta,altaTO-PRO-3), (v) ApoBDs (FSC/SSCbaja, A5intermedio, TO-PRO-3bajo / intermedio) y (vi) escombros (FSC/SSCbajo, A5bajo,bajaPRO-TO-3)20. Nuestro enfoque destaca la importancia de analizar todos los subconjuntos de células/partícula y, más importante aún, la separación de ApoBDs de las células y desechos20. Por lo tanto, este enfoque demuestra una técnica eficiente para validar la inducción de la apoptosis y ApoBD formación simultáneamente.

Tradicionalmente, ApoBDs han sido aislados a través de una variedad de métodos de centrifugación diferencial por el que ApoBDs se puede separar de las células u otras vesículas extracelulares basadas en densidad. Sin embargo, tales métodos de centrifugación a menudo están limitadas por la baja ApoBD pureza, falta de un paso de cuantificación para confirmar la pureza de la muestra, o incapacidad para separar células específicas del tipo ApoBDs17,21,22. Por lo tanto, hemos desarrollado recientemente dos enfoques, basados en un FACS y un nuevo enfoque basado en la centrifugación diferencial que puede ser juntado con nuestro método de citometría de flujo previamente establecido para validar la inducción de apoptosis y muestra pureza23. Aislamiento de ApoBD a través de nuestro enfoque basado en el FACS puede enriquecer ApoBDs hasta 99% de pureza y puede acoplarse con una variedad de anticuerpos de tipo específico para aislar ApoBDs de poblaciones de células mixtas, muestras de tejidos y fluidos corporales23. Además, nuestro enfoque de centrifugación diferencial revisado demuestra un método eficiente para aislar ApoBDs al > 90% pureza23.

En este papel, describimos en detalle nuestro procedimiento experimental para validar la inducción de apoptosis y para detectar y cuantificar la formación de ApoBD. Los flujos de trabajo de aislamiento de ApoBD métodos basados en FACS y diferencial basado en la centrifugación también son elaborados y comparados. Los datos representativos demuestran que la metodología descrita proporciona una eficaz herramienta de vanguardia para estudios futuros de ApoBD.

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Protocolo

1. inducción de la Apoptosis

  1. Centrifugue la muestra celular a 300 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante para eliminar cualquier residuo de células preexistentes.
    Nota: Al utilizar las células adherentes, las células de la semilla de antemano y lavar con solución tampón fosfato (PBS) antes de la inducción de la apoptosis 1 x.
  2. Determinar el número de células y recoger las células.
    Nota: Dependiendo del aislamiento después del ensayo, se recomiendan a un número inicial de células de al menos 1 x 107 células.
  3. Resuspender en medio completo (medio respectivo que contenga 10% (vol/vol) de suero de ternera fetal, 50 IU/mL de penicilina, 50 μg/mL estreptomicina mezcla) para una concentración final de 1 x 106 células/mL.
  4. Alícuota 2 x 106 células por pocillo de una placa bien 6.
  5. Para inducir apoptosis, retire la tapa de la placa e irradiar células en 150 mJ/cm2 con un irradiador UV. Esto debe tomar aproximadamente 30-60 s.
    Nota: Antes de la irradiación, asegúrese que se mantienen ~0.5 x 106 celdas para el control de la célula 'no Tratado'.
    Nota: Apoptosis también puede ser inducida a través de otros métodos como el anti-Fas o suero hambre6.
  6. Incubar a 37° C, 5% CO2 para 2-8 horas, dependiendo de la línea celular.
  7. Usando un microscopio de luz superior del Banco, visualizar células para confirmar la presencia de morfologías apoptóticas, tales como blebbing y apoptopodia formación ApoBD formación.
    Nota: un aumento 40 X es suficiente
  8. Con una pipeta P1000, pipeta y recoger muestras de la apoptosis.
  9. Lavar la placa con PBS 1 x y se combinan con la muestra restante para asegurar rendimiento máximo.
  10. Recoger ~1/10th para la 'muestra de Apoptotic todo' (era) de control.
  11. Recolectar la muestra ''.
  12. Centrifugar las muestras de la era y el no tratado a 3.000 x g durante 6 minutos.
  13. Resuspender en 1 mL de PBS 1 x y dejar de lado en el hielo.
  14. Para el aislamiento de ApoBD, continuar al paso 2 o 3 con la restante muestra apoptótica.

2. ApoBD aislamiento vía FACS

  1. Centrifugar toda la muestra a 3.000 x g durante 6 minutos.
  2. Eliminar la mayoría del sobrenadante sin perturbar el pellet.
  3. Agite en una solución de tinción que contiene 1 mL de tampón de Unión x A5 1, 75 μl de A5-FITC y 2 μl de TO-PRO-3 1 x 107 células.
  4. Incubar la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  5. Añadir 1-2 mL de tampón de Unión x A5 1 y centrifugar la muestra a 3.000 x g durante 6 min remover exceso mancha.
    Nota: Para el mezclado de la célula poblaciones o muestras de tejido, realizar un paso usando una combinación de marcadores específicos del tipo de célula en tampón de Unión x A5 1 la coloración del anticuerpo e incubar en hielo durante 20 minutos (o según protocolo del fabricante) antes de la centrifugación a 3.000 x g durante 6 min.
  6. Resuspender el pellet de la muestra en 3 mL de tampón FACS (PBS 1 x, 1 Tampón de Unión x A5, 10% FSC, 2 mM EDTA) por 1 x 107 células.
  7. Filtrar con un colador de célula 70 μm en un fondo redondo, tubo de polipropileno (citometría de flujo) y mantener las muestras en hielo y en la oscuridad.
  8. Encender la máquina FACS realizar conjunto estándar usando una boquilla de 100 μm, realizar el retardo de caída y asegurar un flujo estable.
  9. La muestra de la carga y la velocidad de a ~ 1000 eventos/s.
  10. Ajuste de FSC y SSC, APC (TO-PRO-3), voltajes FITC (A5) y eventos dentro de las parcelas del FACS para poblaciones se pueden separar claramente de la posición.
  11. Registrar eventos de 20.000.
  12. Establecer una estrategia bloquea en parte 4.
  13. En el diseño de la clase, agregue la puerta final de ApoBD como la población clasificación deseada.
  14. Comenzar la adquisición de la muestra y llevar a cabo una especie de prueba que recoge el ApoBDs de 5.000-10.000 en un nuevo tubo con 250 μl de tampón de FACS.
  15. Realizar un sistema nuevo al ras y separado de la carga ApoBDs.
  16. Adquirir y registrar a prueba-tipo ApoBDs.
  17. Verificar la pureza de ApoBD ~ 99% comparando FSC (eje y) vs A5 (eventos del eje x).
    Nota: A5 tinción puede reducir un poco al volver a analizar las muestras por blanqueamiento láser.
  18. Una vez lograda la pureza elevada, la muestra original de la carga y continuar clasificación hasta obtener el número deseado de ApoBDs.
    Nota: Si es necesario, doble clasificación puede realizarse para aislar simultáneamente ApoCells y ApoBDs.
    Nota: Al ordenar durante un largo período de tiempo, se recomienda incubar el tubo de la colección a 4 ° C.
  19. Clasificación es completa, recoger una pequeña porción de la clase ApoBDs, la clase ApoCells, no tratado y era apoptosis de validar y confirmar la pureza de la especie.
    Nota: Aunque la prueba-clase y pureza de la especie no deberán diferir significativamente, esto se basa en la configuración de flujo y estabilidad.

3. ApoBD aislamiento mediante centrifugación diferencial

  1. Centrifugue la muestra restante de apoptosis a 300 x g durante 10 minutos.
  2. Recoger el sobrenadante, dejando ~ 500 μL para evitar perturbar el sedimento celular y agregar en un nuevo tubo cónico de 15 mL.
  3. Eliminar los restantes 500 μl y resuspender el precipitado de células en 2 mL de PBS 1 x (esto representa la fracción de ApoCell enriquecido.
  4. Centrifugar el sobrenadante recogido por 20 min a 3.000 g.
  5. Comprobar si una pelotilla y retire con cuidado el sobrenadante (el sobrenadante puede contener pequeñas vesículas extracelulares como microvesículas y exosomas).
  6. Resuspender el precipitado en 1 mL de PBS 1 x (esto representa la fracción 'enriquecida con ApoBD')
  7. Recoger 100 μl de cada Viable, WAS, enriquecida con ApoCell y muestras enriquecidas con ApoBD en un fondo redondo nuevo, tubo de poliestireno (citometría de flujo).
  8. Añada 100 μl de colorante que contiene 2 x A5 tampón de Unión, 1: 100 A5-FITC y 1:1,000 TO-PRO-3
  9. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min en la oscuridad.
  10. Análisis de muestras por citometría de flujo, usando la estrategia bloquea como se describe arriba para validar la exitosa inducción de apoptosis y la pureza de la fracción enriquecida con ApoBD.

4. flujo Cytometry Gating estrategia

  1. Parcela a-PRO-3 (eje y) contra FSC (eje x) para separar células necróticas (TO-PRO-3alto) de todos los demás no permeabilized eventos (TO-PRO-3bajo/intermedio).
  2. Seleccione todos los eventos no permeabilized y parcela SSC contra A5. Puerta de dos poblaciones incluyendo la población 1 (P1), SSCintermedio/alto, A5bajo intermedio células y 2 (P2), todos los demás eventos.
  3. P2, parcela a-PRO-3 contra A5 y seleccione A5intermedio/alto eventos para excluir todos los desechos de la célula.
  4. Seleccione todos los eventos positivos de A5 y parcela FSC contra A5. Separar ApoBDs (FSCbajo) ApoCells (FSCintermedio/alto).
    Nota: Sincronización ApoBDs para el aislamiento de ApoBD mediante el enfoque de FACS, recomendamos un paso final seleccionando ApoBDs y comparando a PRO-3 A5 y todos los eventos. Esto asegura que la puerta de clasificación final utiliza fluorescencia en lugar de parámetros FSC/SSC.
  5. Para el análisis de células viables, seleccione P1 y realice una de dos estrategias bloquea. Para el análisis general célula viable, parcela FSC contra A5 y seleccionar todas las celdas deintermedio y alto FSC, por lo tanto eliminando restos celulares restantes. Por otra parte, para el análisis en profundidad, células viables se pueden separar de A5– ApoCells temprano trazando TO-PRO-3 contra el FSC. Seleccionar TO-PRO-3bajo, células viables deintermedio y alto FSC y TO-PRO-3intermedios, FSCintermedio/alto A5– ApoCells temprano.

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Resultados

Utilizando el procedimiento descrito aquí, se indujo la apoptosis de monocitos THP-1 y ApoBDs fueron detectados y aislados mediante FACS-basado o un método de centrifugación diferencial (figura 1). En primer lugar, apoptosis fue inducida por la irradiación UV y se tomaron muestras después de 2-3 h de incubación, cuando las células exhiben morfologías apoptóticas, incluyendo blebbing, apoptosis formación de protusión de la membrana y la generación de ApoBDs

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Discusión

Desde su primera descripción en la década de 1950, el campo de la apoptosis ha avanzado notablemente, convirtiéndose en un área de investigación prominentes. A pesar del interés general y grandes esfuerzos, ciertos aspectos de la apoptosis, en particular la formación de ApoBDs, no han sido bien estudiados debido a la falta de metodologías apropiadas. Estos incluyen en particular la limitación en el seguimiento de la progresión de la apoptosis y la formación de ApoBD simultáneamente utilizando la citometría de flujo tradi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de salud nacional y Consejo de investigación médica (GNT1125033 y GNT1140187) y Australian Research Council (DP170103790) a I.K.H.P.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Células, por ejemplo, monocitos THP-1 humanos cultivados (número de clon: TIB-202)Medio ATCC-RPMI
1640Life Technologies22400-089
Mezcla de penicilina y estreptomicinaLife Technologies15140122
FSCGibco10099-141
1x PBS--
Anexina V FITCBD Elde
Life TechnologiesT3605TO-PRO-3 puede causar irritación de la piel, los ojos y las vías respiratorias. Evite el contacto directo.
10x Tampón de unión de anexina VBD Bioscience556454
EDTASigma-Aldrich1001710526
Tubo de centrífuga (15 mL)Cellstar188271
Tubo de microcentrífuga (1,5 mL)Sarstedt72.690.001
Incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% CO2)--
CentrífugaBeckman Coulter392932
Citómetro de flujo FACS ARIA III, configurado con dos láseres para la detección FITC y APCBD Bioscience-FACS
Canto II Citómetro de flujo, configurado con dos láseres para la detección FITC y APCBioscience-FACS
Diva 6.1.1 softwareBD Bioscience-
Software FlowJo 8.8.6--
  UV Stratalinker 1800Stratagene-
yoduro Bioscience-TO-PRO-3 BD

Referencias

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