Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

Esam S.B. Salem; Kazutoshi Murakami; Toshimasa Takahashi; Elise Bernhard; Vishnupriya Borra; Mridula Bethi; Takahisa Nakamura

doi:10.3791/58323

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Artículo de método

Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

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DOI:

10.3791/58323

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23 de octubre de 2018

Esam S.B. Salem^*¹^,² , Kazutoshi Murakami^*² , Toshimasa Takahashi² , Elise Bernhard² , Vishnupriya Borra² , Mridula Bethi² , Takahisa Nakamura²^,³^,⁴

¹Department of Pharmacology and Systems Physiology, College of Medicine, University of Cincinnati, ²Division of Endocrinology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ³Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ⁴Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Cincinnati

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de hepatocitos primario de ratón sano y funcional. Para detectar la síntesis hepática de la proteína naciente por substrato etiquetado no radiactivo se instrucciones para ayudar a comprender los mecanismos subyacentes a la síntesis de proteínas en el marco de la homeostasis del metabolismo energético en el hígado.

Resumen

Hepatocitos son células parenquimatosas del hígado y realizar múltiples funciones metabólicas, incluyendo la síntesis y secreción de proteínas esenciales para la homeostasis de energía sistémica. Hepatocitos primarios aislados del hígado murino constituyen una valiosa herramienta biológica para comprender las propiedades funcionales o alteraciones que se producen en el hígado. Aquí describimos un método para el aislamiento y cultivo de hepatocitos primario de ratón mediante la realización de una técnica de perfusión de colagenasa de dos etapas y discutir su utilización para la investigación de metabolismo de la proteína. El hígado de un ratón adulto secuencialmente es inundado con ácido tetraacético de glicol de etileno bis (EGTA) y colagenasa, seguido por el aislamiento de hepatocitos con el tampón de gradiente de densidad. Estos hepatocitos aislados son viables en las placas de cultivo y mantienen la mayoría de características dotadas de hepatocitos. Estos hepatocitos pueden utilizarse para la evaluación del metabolismo de proteína incluyendo la síntesis de la proteína naciente con reactivos no radiactivo. Demostramos que los hepatocitos aislados son controlados fácilmente y forman una mayor estabilidad de la calidad y el volumen de la síntesis de proteínas vinculada al metabolismo energético mediante la utilización de la reacción de ligadura quimioterapia selectiva a una proteína Tetramethylrhodamine (TAMRA) método de detección y análisis Blot western. Por lo tanto, este método es valioso para la investigación de síntesis de la proteína naciente hepática relacionada con la homeostasis de la energía. El siguiente protocolo describe los materiales y métodos para la detección de la síntesis de la proteína naciente y el aislamiento de hepatocitos primario de alta calidad de ratón.

Introducción

La proteína es un elemento nutricional importante y aproximadamente el 50% del peso seco de un cuerpo humano está compuesto de proteínas que tienen varios rasgos biológicos y funciones¹. En consecuencia, la síntesis de proteínas es uno de los eventos que la mayoría de energía y una alteración en el metabolismo de la proteína es altamente asociada con el desarrollo de enfermedades, incluyendo enfermedades metabólicas²^,³^,⁴. En el hígado, biosíntesis de la proteína representa aproximadamente 20 – 30% del total de energía consumo⁵