Este protocolo describe la implantación de una ventana de vidrio en la médula espinal de un ratón para facilitar la visualización mediante microscopía intravital.
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Artículo de método
Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe un método para la laminectomía de la médula espinal y la implantación de ventanas de vidrio para la toma de imágenes in vivo de la médula espinal del ratón. Un vaporizador digital integrado se utiliza para lograr un plano estable de anestesia a una velocidad de bajo flujo de isoflurano. Se retira una sola columna vertebral, y se superpone un vidrio de cubierta disponible comercialmente en un lecho de agarosa delgada. A continuación, se fija una placa posterior de plástico impresa en 3D a las espinas vertebrales adyacentes utilizando adhesivo tisular y cemento dental. Se utiliza una plataforma de estabilización para reducir el artefacto de movimiento de la respiración y los latidos del corazón. Este método rápido y libre de abrazaderas es adecuado para la microscopía aguda de fluorescencia multifotón. Se incluyen datos representativos para la aplicación de esta técnica a la microscopía de dos fotones de la vasculatura de la médula espinal en ratones transgénicos que expresan eGFP:Claudin-5 — una proteína de unión apretada.
Introducción
Los modelos animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes, cuando se combinan con la microscopía intravital, proporcionan una potente plataforma para abordar la biología y la fisiopatología. Para aplicar estas técnicas a la médula espinal, se requieren protocolos especializados para preparar la médula espinal para la toma de imágenes. Una de esas estrategias es llevar a cabo una laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal. Las características clave de un protocolo de laminectomía ideal para la microscopía incluyen la preservación de la estructura y función del tejido nativo, la estabilidad del campo de la imagen, el tiempo de procesamiento rápido y la reproducibilidad de los resultados. Un desafío particular es estabilizar el campo de imagen contra el movimiento inducido por la respiración y los latidos del corazón. Múltiples estrategias ex vivo e in vivo han sido reportadas para alcanzar estos objetivos1,2,3,4,5. La mayoría de los métodos in vivo implican sujetar los lados de la columna vertebral2,4 y a menudo es seguido por la implantación de un aparato metálico rígido3,4 para la estabilidad durante la cirugía y aplicaciones de imágenes posteriores. Sujetar la columna vertebral puede comprometer potencialmente el flujo sanguíneo e inducir la remodelación de proteínas de barrera hematoencefálica (BBB).
El propósito de este método es hacer que la médula espinal intacta esté disponible para imágenes ópticas en el ratón vivo, minimizando al mismo tiempo la invasividad del protocolo y mejorando los resultados. Describimos una sola laminectomía y un procedimiento de implantación de vidrio de cubierta combinado con una placa posterior impresa en 3D de plástico ovalada mínimamente invasiva que todavía logra una estabilidad mecánica robusta. La placa posterior se adhiere directamente a las espinas vertebrales anteriores y posteriores con cemento dental. La placa posterior está equipada con brazos de extensión lateral con orificios de tornillo que se fijan rígidamente a la etapa del microscopio a través de un brazo metálico. Esto ancla eficazmente la vértebra anterior y posterior intacta a la etapa del microscopio, proporcionando resistencia mecánica al artefacto de movimiento que de otro modo sería introducido por la respiración y los latidos del corazón. El método ha sido optimizado para la laminectomía de una sola vértebra a nivel torácico 12, omitiendo las abrazaderas utilizadas en estrategias alternativas de estabilidad durante la imagen in vivo. El procedimiento es rápido, tardando aproximadamente 30 minutos por ratón.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de la enfermedad de la BBB. El BBB es un sistema microvascular dinámico compuesto por células endoteliales, músculo liso vascular, pericitos y procesos de pie astrocito que proporcionan un ambiente altamente selectivo para el sistema nervioso central (SNC). Los datos representativos describen la aplicación de este protocolo en ratones transgénicos diseñados para expresar proteína fluorescente verde mejorada (eGFP):Claudin-5, una proteína de unión estrecha BBB. Los archivos de impresión de placa posterior proporcionados también se pueden personalizar para aplicaciones alternativas.
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Protocolo
Todos los experimentos siguen los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois, Chicago. Este es un procedimiento terminal.
1. Preparación de reactivos
- Preparar el líquido cefalorraquídeo cerebral artificial (aCSF) para que contenga 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glucosa, 10 mM de HEPES, 2 mM MgCl2s6H2O, 2 mM de CaCl2x 2HendDH2O. Filtro estéril y congelar en alícuotas de uso individual. Caliente el aCSF en un baño de agua a 39 oC antes de su uso.
- Agarosa cálida de bajo punto de fusión (2%) en aCSF hasta que se disuelva completamente en un baño de agua ajustado a 65 oC. Durante la laminectomía, enfríe la alícuota de agarosa derretida a 39 oC en un baño de agua, para que pueda estar lista cerca de la temperatura fisiológica para el paso 5.2.
Nota: La solución de agarosa se puede almacenar a -20 oC en alícuotas de un solo uso. - Preparar 50 mg/ml de carprofeno estéril en agua bacteriostática. Conservar a 4oC.
- Limpie los anteojos con 70% de etanol, tres lavados de ddH2O y guárdelos secos en un recipiente libre de polvo.
2. Impresión 3D de placa posterior
- El software CAD 3D de uso se utiliza para crear un modelo a las dimensiones que se muestran en la Figura 1. El interior es una elipse más ancha en la superficie inferior con respecto a la impresora y cortada con un corte recubierto a una elipse más pequeña formando un lumen en la superficie opuesta. Dos brazos de proyección con orificios para aceptar tornillos se extienden lateralmente, para la fijación a la horquilla de sujeción de la placa posterior. A partir de esta estructura 3D, cree un archivo de malla 3D triangulado (. STL).
Nota: Vea la figura 1B-u2012D y los archivos suplementarios 1 y 2. - Cargue el archivo de malla 3D triangulado en una impresora 3D.
- Imprima placas posteriores utilizando una boquilla de extremo caliente de 0,4 mm y una altura de capa de 0,2 mm. Seleccione la temperatura de la boquilla de 205 oC, la temperatura de la cama de 45 oC y la velocidad de impresión de 45 mm/s.
- Evaluar visualmente las placas posteriores impresas en 3D resultantes para la integridad estructural(Figura 1E); fallo estructural bruto (ausente lumen, pared colapsada) indica defectos de impresión(Figura 1F).
3. Preparación quirúrgica
- Precalienta la almohadilla de calentamiento.
- Cargue el isoflurano en la jeringa de entrega mientras trabaja en una campana de humo sordo químico. Coloque la jeringa de administración en la unidad de isoflurano.
- Seleccione un ratón de 8 u201212 semanas. Pesa el animal. Inducir la anestesia usando 2% de isoflurano en una cámara de inducción. Inyectar carprofeno a 5 mg/kg por vía subcutánea.
- Coloque el cono nasal y entregue isoflurano al 2% con un caudal de 150 ml/min para el mantenimiento de un plano quirúrgico de anestesia(Figura 2A.u2012E). Envuelva la almohadilla de calentamiento con una almohadilla absorbente desechable para facilitar la limpieza.
- Coloque un animal en la almohadilla de calentamiento en la estación quirúrgica e instale el cono nasal. Lubricar el termómetro con vaselina e insertarlo 5 mm en el recto. Pegue la sonda del termómetro a la cola para la estabilidad. Aplique pomada oftálmica a los ojos del ratón.
- Para mantener la hidratación, aplique 200 ml de solución de Ringer lactada por inyección subcutánea cada 30 minutos hasta la terminación del experimento.
- Rocíe el dorso con 70% de etanol, retire el pelaje con cortadoras y limpie el sitio con povidona-yodo.
4. Laminectomía
- Coloque el animal entre las barras de los oídos; estos mantienen la posición de la cabeza del ratón con respecto al cono nasal.
- Confirme que el animal está profundamente anestesiado según lo evaluado por la falta de reflejo de pellizco interdigital y patrón respiratorio constante.
- Hacer una incisión rostral-caudal de 1,5 cm en la línea media sobre la región torácica/lumbar superior inferior usando #11 cuchilla(Figura 2). Separa la piel agarrándola con fórceps dentados contundentes y/o dedos enguantados. Use fórceps para separar y pelar cualquier tejido conectivo transparente restante debajo de la piel. La musculatura superficial ahora debe ser expuesta; desplazar esto con una lanza quirúrgica de espuma.
- Utilice lanzas quirúrgicas de espuma (o una cureta) para eliminar la musculatura más profunda y restante de la vértebra diana (torácica 12). Para crear un asiento para la placa posterior, también despeje el músculo del aspecto posterior del torácico 11, y el aspecto anterior del torácico 13. Controle cualquier sangrado aplicando una presión suave con una lanza quirúrgica o use un pulso mínimo con una pistola de cauterización. Continúe retirando el músculo restante de los tendones usando fórceps
- Una vez que se retiran los músculos, separa cuidadosamente los tendones cortando con fórceps. Debe haber mucho espacio para visualizar y manipular el cable cuando este paso se haya completado. Compruebe que la duración del espacio intervertebral, el hueso laminar semitransparente, el vaso sanguíneo superficial central debajo del hueso y la arteria radiante anterior son ahora claramente visibles.
- Humedezca la región con aCSF caliente. Utilice el microrretaparacropara adelgazar repetitivamente el hueso laminar utilizando trazos rectos paralelos al eje largo de la médula espinal(Figura 2, Figura 3). Si lo desea, utilice una etapa de deslizamiento para girar la plataforma quirúrgica para una mayor comodidad ergonómica (por ejemplo, un operador diestro puede girar la plataforma quirúrgica en sentido antihorario para el paso de perforación).
Nota: La etapa de deslizamiento utilizada está construida con una placa de aluminio superior que se desliza de 15 mm con respecto a la placa base fija. - Agarre suavemente el proceso espinoso superficial con fórceps y levante la vértebra; el hueso debe levantarse fácilmente. Si hay resistencia, repita el adelgazamiento del hueso con el taladro y, si es necesario, utilice tijeras de iris, teniendo cuidado de apuntar las puntas de las tijeras hacia arriba para evitar dañar el tejido.
Nota: Para mantener la dura intacta, es esencial no tirón del hueso. - Usa #4 fórceps para eliminar cualquier fragmento óseo. Use una lanza quirúrgica para aplicar una presión constante suave para controlar cualquier sangrado. Enjuague el tejido con aCSF caliente. No permita que el tejido se seque.
5. Implantación de vidrio de cubierta
- Aplique suavemente un vidrio de cubierta de borosilicato de 3 mm en el cable expuesto.
- Asegúrese de que la agarosa se enfríe a 39 oC. Usando una pequeña espátula, aplica un 2% caliente de agarosa/aCSF en el borde de la cubierta de vidrio y permite que la acción capilar la dibuje debajo de la superficie.
Nota: A temperaturas por debajo de 39 oC, la agarosa puede comenzar a gelificarse. Si esto ocurre, vuelva a calentar con un baño de agua o un microondas. Algunos operadores prefieren aplicar primero una gota de agarosa y poner el vidrio de la cubierta en la parte superior. - Aplicar adhesivo tisular a los procesos articulares óseos expuestos de la vértebra adyacente intacta a nivel torácico 11 espina vertebral y columna vertebral de nivel torácico 13. Aplique adhesivo de tejido adicional en un anillo alrededor del sitio de la laminectomía, sobre el tendón adyacente y el proceso transversal.
Nota: Se requiere adhesivo tisular para la correcta adherencia del cemento dental en los pasos posteriores. Los procesos articulares forman un asiento natural sobre el cual la placa posterior puede descansar de forma estable(Figura 3). La adhesión a los procesos articulares formará los puntos más fuertes de unión. - Mezclar cemento dental con acelerador en una bandeja de mezcla de porcelana. Utilice una pequeña espátula para transferir cemento dental a la capa adhesiva de tejido. Utilice cemento dental para adherir la placa posterior al campo quirúrgico, centrado sobre la ventana. Espere 10 minutos para que el cemento dental se cure.
Nota: La adhesión firme de la placa posterior a los procesos articulares anteriores y posteriores proporciona la estabilidad estructural fundamental del implante. - Utilice cemento dental adicional para rellenar la base interior de la placa posterior, y la parte inferior de la placa posterior: interfaz de tejido.
Nota: La aplicación adicional de cemento dental mejora la adherencia y reduce el riesgo de fuga del fluido de inmersión objetivo del microscopio (salina) en la parte inferior de la placa posterior. - Avance el soporte de la placa posterior bifurcada a la posición adecuada sobre la ventana. Fije la placa posterior en el soporte de la placa posterior con tornillos.
Nota: Este protocolo utilizaba un soporte de placa posterior mecanizado a medida(Figura 2G.u2012H). - Aplique salina a la placa posterior para comprobar si hay fugas. Si hay fugas de líquido, seque el área y aplique más cemento dental.
6. Preparación de imágenes
- Transfiera el animal de la plataforma quirúrgica a la mesa óptica.
Nota: Nuestra plataforma quirúrgica, soporte de placa posterior, y soporte de nariz-cono de isoflurano se pueden transportar entre estaciones de imágenes quirúrgicas y de dos fotones como una unidad, mientras se aplica anestesia isoflurano continua(Figura 2D,H). Unidades similares se pueden ensamblar a partir de horquillas de sujeción, vigas y postes de pilares de apoyo que se pueden obtener de fuentes comerciales(por ejemplo,. ThorLabs). Para la microscopía intravital, debe haber al menos 11 pulgadas de espacio libre entre el objetivo del microscopio y la mesa óptica para acomodar la altura de la plataforma quirúrgica. - Fije la plataforma quirúrgica a la mesa óptica utilizando un poste de montaje de acero inoxidable y una horquilla de sujeción contraborde.
- Aplique salina fresca en el pozo de la placa posterior. Baje una lente de inmersión en agua en el pozo.
- Utilice la luz transmitida o epifluorescencia para identificar el área de interés y enfoque. Cambie al modo de escaneo láser y realice imágenes in vivo de acuerdo con la longitud de onda de excitación láser de dos fotones adecuada, dicroics y filtros de paso de banda para los fluoróforos presentes en el tejido6.
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Resultados
Las ventanas de vidrio implantadas y la microscopía intravital de dos fotones proporcionan una herramienta útil para evaluar los cambios dinámicos en las proteínas del SNC. La integridad funcional del BBB está influenciada por la expresión, la localización subcelular y las tasas de rotación de proteínas de uniónestrecha7. Estudios anteriores han demostrado que las proteínas de unión estrecha sufren una remodelación rápida y dinámica en estado estacionario
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Discusión
El método descrito aquí permite imágenes estables de la médula espinal en ratones a través de una ventana de vidrio. Este método se ha aplicado para evaluar la remodelación de BBB en ratones transgénicos eGFP:Claudin5+/- que expresan una proteína fluorescente de unión estrecha BBB, pero podría aplicarse igualmente bien para estudios de cualquier proteína fluorescente o células en la médula espinal.
Se han desarrollado múltiples métodos para la laminectomía y estabilización de la médula espinal...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
S.E. Lutz cuenta con el apoyo del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, los Institutos Nacionales de Salud, bajo los fondos de inicio de Grant KL2TR002002 y University of Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford es compatible con RO1 MH084874. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH. Los autores agradecen a Dritan Agalliu en el Departamento de Neurología del Centro Médico de la Universidad de Columbia por los ratones Tg eGFP:Claudin-5, discusiones científicas e ideas sobre el desarrollo del protocolo quirúrgico y las aplicaciones de imagen. Los autores agradecen a Sunil P. Gandhi en el Departamento de Neurobiología y Comportamiento de la Universidad de California, Irvine por diseñar el primer prototipo del aparato estereotáctico y controlador de temperatura animal, la discusión del protocolo quirúrgico, y formación en microscopía de dos fotones. Los autores también agradecen a Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) por su ayuda en la personalización del estereomicroscopio quirúrgico, y a Ron Lipinski (Whale Manufacturing) por el mecanizado de piezas estereotácticas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Impresora 3D | Raise3D | Pro2 | Para la impresión de placas traseras |
| PLA Filamento de impresión 3D | Interior | PLA+-175-B | Material de impresión 3D de plástico negro |
| Software CAD 3D Software | Dassault Systèmes | Solidworks | utilizado para diseñar formas 3D |
| Software de impresora 3D | Raise3D | Software Ideamaker | utilizado para interactuar con la impresora 3D |
| Placa posterior ovalada impresa en 3D | personalizada | Estabilización del campo de imagen | |
| Microscopio de disección quirúrgica | Leica | M205 C | Equipado con Leica FusionOptics, objetivo de la serie M Planapo 0.63x y platina deslizante |
| Cámara microscópica | Leica | MC170 | HD Cámara en color para visualizar el campo quirúrgico |
| Platina deslizante | Leica | 10446301 | La etapa de deslizamiento está construida con dos placas metálicas. La placa base es fija. La placa superior se desliza sobre una interfaz engrasada para permitir el movimiento giratorio y lineal. |
| Estación quirúrgica y horquilla de estabilización | Whale Manufactoring | laminectomía | personalizada |
| Unidad de administración de isoflurano de bajo flujo SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 Administración de | anestesia quirúrgica con vaporizador digital integrado |
| Poste de montaje de acero inoxidable de 1,5 pulgadas | ThorLabs | P50/M | Para el montaje de la estación quirúrgica en una mesa óptica para la obtención de imágenes |
| de dos fotonesHorquilla de apriete avellanada para montaje de 1,5" Post | ThorLabs | PF175 | Para estabilizar el montaje de la estación quirúrgica en la mesa óptica para la obtención de imágenes de dos fotones |
| Microtaladro óseo ideal | Aparato Harvard | 72-6065 | Adelgazamiento de hueso para laminectomía |
| Baño de agua | Fisher Scientific | 15-462-10 | Solución salina de calentamiento |
| Pistola de cauterización | FST | 18010-00 | Cauterización menor Calentador |
| Benchmark | BF11222 | silicona de 1.9" x 4.5" con 20" Cables de teflón, 10 W, 5 V | |
| Sonda rectal termoacoplada tipo K | Physitemp | RET3 | Medición de la temperatura corporal del ratón |
| vaselina | Sigma | 8009-03-8 | Sonda rectal lubricante |
| Controlador térmico regulado por retroalimentación | NA personalizado | Las alternativas disponibles en el mercado incluyen la serie Physitemp TCAT | |
| PVA Lanza ocular quirúrgica | Beaver-visitec internacional | 40400-8 | Absorbente de sangre |
| Recortadora eléctrica | Wahl | 41590-0438 | Recorte de piel de ratón |
| Cuchilla, #11 | FST | 14002-14 | Herramienta quirúrgica |
| Pinzas, #5 | FST | 11254-20 | Herramienta quirúrgica |
| Pinzas, #4 | FST | 14002-14 | Herramienta quirúrgica |
| Pinzas dentadas de titatnium | WPI | 555047FT | Herramienta quirúrgica |
| Tijeras de iris de titanio | WPI | 555562S | Herramienta quirúrgica |
| Vetbond adhesivo para tejidos | 3M | 084-1469SB Preparación de | la superficie del tejido para acrílico dental |
| Bandeja mezcladora de cerámica | Jack Richeson | 420716 | Mezcla de agente acrílico dental con acelerante |
| Acrílico dental Orthojet | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Adhesión permanente de la placa posterior al tejido |
| Cubreobjetos redondos pequeños, #1 de grosor, 3 mm | Aparato Harvard | 64-0720 | ventana óptica |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | Para aCSF |
| KCl Fisher | Scientific | 7447-40-7 | Para aCSF |
| Glucosa | Fisher Scientific | 50-99-7 | Para aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Para aCSF |
| MgCl2& punto medio; 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | para aCSF |
| CaCl2· 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Para aCSF |
| Carprofeno | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Agua bacteriostática | Henry Schein | 2587428 | Diluyente para carprofeno |
| Isoflurano | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anestesia |
| Solución ringer lactada | Baxter | 0338-0117-04 | Hidratación para ratón |
| Agarosa High EEO | Sigma | A9793 | punto de gel 34-37 grados C |
| Pomada lubricante oftálmica | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevenir la sequedad de la córnea |
| MOM Microscopio de dos fotones | Sutter |
Referencias
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- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
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Reimpresiones y permisos
