Los procesos de invasión del cáncer de vejiga representan oportunidades para el desarrollo terapéutica y biomarcadores. Aquí presentamos un modelo de invasión de cáncer de vejiga que incorpora 3D cultura de esferoides tumorales, proyección de imagen de Time-lapse y microscopía confocal. Esta técnica es útil para definir las características del proceso invasivo y para la detección de agentes terapéuticos.
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Artículo de método
Sistema del cultivo celular 3-d para invasión de estudiar y evaluar la terapéutica en el cáncer de vejiga
En este artículo
Resumen
Resumen
Cáncer de vejiga es un importante problema de salud. Se estima que más de 16.000 personas morirán este año en los Estados Unidos de cáncer de vejiga. Mientras que el 75% de los cánceres de vejiga son no invasivas y poco probable metástasis, alrededor del 25% progresar a un patrón de crecimiento invasivo. Hasta mitad de los pacientes con cánceres invasivos desarrollan letal recaída metastásica. Por lo tanto, comprender el mecanismo de progresión invasiva en el cáncer de vejiga es crucial para predecir los resultados del paciente y prevenir metástasis letal. En este artículo, presentamos un modelo de invasión del cáncer tridimensional que permite la incorporación de las células tumorales y los componentes stromal a imitar en vivo condiciones que ocurren en el microambiente del tumor de vejiga. Este modelo ofrece la oportunidad de observar el proceso invasivo en tiempo real usando proyección de imagen de Time-lapse, interrogar las vías moleculares implicadas confocales compuestos inmunofluorescentes de la proyección de imagen y pantalla con el potencial de invasión bloque. Aunque este protocolo se centra en el cáncer de vejiga, es probable que métodos similares podrían utilizarse para examinar la invasión y motilidad así como otros tipos de tumor.
Introducción
La invasión es un paso crítico en la progresión del cáncer, que se requiere para la metástasis y se asocia a menor supervivencia y pronóstico en los pacientes. En el cáncer de vejiga humano, la neoplasia más frecuente del tracto urinario, que causa unos 165.000 muertes por año en todo el mundo, pronóstico, tratamiento y etapa del cáncer se relacionan directamente con la presencia o ausencia de invasión1. Alrededor del 75% de los casos de cáncer de vejiga se no músculo invasivo y se manejan con resección local. Por el contrario, los cánceres de vejiga músculo invasivo (aproximadamente 25% de los casos) son tumores agresivos con altas tasas de me....
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Protocolo
1. creciente cáncer esferoides
-
Crecimiento de líneas celulares
- Células de cáncer de vejiga humana cultura bajo adherente convencional condiciones de cultivo de células y mantienen en un incubador de 37 º C suministrado con 5% CO2. Mantener las células en < 90% de confluencia.
Nota: medios de cultivo utilizados es de Dulbecco modificado medio esencial mínimo (DMEM) que contiene 4,5 g/L D-glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio 110 mg/L y con 10% suero bovino fetal (FBS) a lo largo de este protocolo. - Un día antes del inicio del experimento, trypsinize (usando 0.25% tripsina-EDTA) cuantificar la concentración....
- Células de cáncer de vejiga humana cultura bajo adherente convencional condiciones de cultivo de células y mantienen en un incubador de 37 º C suministrado con 5% CO2. Mantener las células en < 90% de confluencia.
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Resultados
Creación exitosa de esferoide de tumor de cáncer de vejiga invasivo requiere la formación de esferoides tumorales tamaño adecuado de líneas de células o tumores primarios. Figura 2 A muestra de tamaños adecuado esferoides desarrollados a partir de líneas de células de cáncer de cuatro vejiga humana (UM-UC9 UC13 UM, UM UC14, 253J y UM UC18). Figura 2 B muestra un tumor esferoidal de un tumor de ve.......
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Discusión
Aquí describimos un modelo esferoide de tumor 3-d que permite la observación en tiempo real de invasión del cáncer de vejiga que es crítica para la metástasis y la progresión del cáncer. Este sistema es favorable a la incorporación de distintos componentes stromal y celulares para permitir a los investigadores mejor Recapitulemos el microambiente del tejido donde ocurre la invasión del cáncer de vejiga. Esferoides de cáncer de vejiga puede ser generadas de diversas fuentes como líneas celulares (incluyendo líneas celular.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el laboratorio del Dr. Howard Crawford (Universidad de Michigan) para el soporte técnico y proporcionando materiales y equipos para este estudio y Alan Kelleher para soporte técnico.
Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Michigan Rogel cáncer centro Core Grant CA046592-26S3, CA201335 de NIH K08-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Líneas celulares de cáncer de vejiga humana UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| Medio de cultivo celular DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific 26140079 | ||
| Antibiótico-Antimicótico (100x) | Thermo Fisher Scientific 15240062 | ||
| Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Clúster de 6 pocillos de conexión ultrabaja | Corning | 3471 | |
| Microscopio invertido convencional | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | Uso general para cultivo celular y control de esferoides |
| Colágeno tipo 1 de cola de rata, alta concentración; | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Microscopio confocal | Thermo Fisher Scientific | ||
| confocal | Carl Zeiss | LSM800 | Un miscoscopio confocal con cámara climática, imágenes de múltiples ubicaciones y función de escaneo Z-stack |
| Microtomo criostato | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Software de procesamiento de imágenes | Carl Zeiss | ||
| Solución de paraformaldehído | Ciencias de Microscopía Electrónica | 15710 | |
| ImmEdge Barrera hidrofóbica Pluma PAP | Laboratorios de vectores | Compuesto H4000 | |
| O.C.T | Thermo Fisher Scientific 23730571 | ||
| solución Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anticuerpo Anti-ATDC (Trim29) | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anticuerpo Anti-Citoqueratina 14 | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentina | anticuerpo Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Medio de montaje |
Referencias
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C.
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Reimpresiones y permisos
