Los procesos de invasión del cáncer de vejiga representan oportunidades para el desarrollo terapéutica y biomarcadores. Aquí presentamos un modelo de invasión de cáncer de vejiga que incorpora 3D cultura de esferoides tumorales, proyección de imagen de Time-lapse y microscopía confocal. Esta técnica es útil para definir las características del proceso invasivo y para la detección de agentes terapéuticos.
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Artículo de método
Sistema del cultivo celular 3-d para invasión de estudiar y evaluar la terapéutica en el cáncer de vejiga
En este artículo
Resumen
Resumen
Cáncer de vejiga es un importante problema de salud. Se estima que más de 16.000 personas morirán este año en los Estados Unidos de cáncer de vejiga. Mientras que el 75% de los cánceres de vejiga son no invasivas y poco probable metástasis, alrededor del 25% progresar a un patrón de crecimiento invasivo. Hasta mitad de los pacientes con cánceres invasivos desarrollan letal recaída metastásica. Por lo tanto, comprender el mecanismo de progresión invasiva en el cáncer de vejiga es crucial para predecir los resultados del paciente y prevenir metástasis letal. En este artículo, presentamos un modelo de invasión del cáncer tridimensional que permite la incorporación de las células tumorales y los componentes stromal a imitar en vivo condiciones que ocurren en el microambiente del tumor de vejiga. Este modelo ofrece la oportunidad de observar el proceso invasivo en tiempo real usando proyección de imagen de Time-lapse, interrogar las vías moleculares implicadas confocales compuestos inmunofluorescentes de la proyección de imagen y pantalla con el potencial de invasión bloque. Aunque este protocolo se centra en el cáncer de vejiga, es probable que métodos similares podrían utilizarse para examinar la invasión y motilidad así como otros tipos de tumor.
Introducción
La invasión es un paso crítico en la progresión del cáncer, que se requiere para la metástasis y se asocia a menor supervivencia y pronóstico en los pacientes. En el cáncer de vejiga humano, la neoplasia más frecuente del tracto urinario, que causa unos 165.000 muertes por año en todo el mundo, pronóstico, tratamiento y etapa del cáncer se relacionan directamente con la presencia o ausencia de invasión1. Alrededor del 75% de los casos de cáncer de vejiga se no músculo invasivo y se manejan con resección local. Por el contrario, los cánceres de vejiga músculo invasivo (aproximadamente 25% de los casos) son tumores agresivos con altas tasas de metástasis y son tratados con terapia de multimodality agresivo2,3. Por lo tanto, entender las vías moleculares que desencadenan la invasión es esencial para caracterizar mejor el riesgo de progresión invasiva y para desarrollar intervenciones terapéuticas que pueden prevenir la progresión invasiva.
La progresión invasiva del tumor se produce en un entorno de (3D) tridimensional complejo e implica la interacción de tumor de la célula con otras células del tumor, estroma, membrana basal y otros tipos de células incluyendo las células inmunes, fibroblastos, células musculares y vasculares células endoteliales. Permeable al soporte (por ejemplo, Transwell) sistemas de ensayo se emplean comúnmente para cuantificar cáncer células invasión4, pero estos sistemas son limitados porque no permiten el seguimiento microscópico del proceso de invasión en tiempo real y la recuperación de muestras para coloración adicional y el análisis molecular es un reto. Desarrollo de un sistema de esferoide de tumor de vejiga 3-d para estudiar invasión es deseable porque permite la incorporación de componentes microambiental definidos con la conveniencia de sistemas in vitro .
En este protocolo, se describe un sistema para interrogar a los procesos de invasión de las células cancerosas de la vejiga humana mediante un ensayo de invasión esferoide 3D incorporación de matrices de gel de colágeno y la microscopia confocal para permitir a los investigadores controlar la motilidad celular y invasión en tiempo real (figura 1A). Este sistema es versátil y puede ser modificado para interrogar a varios ajustes del estroma tumoral. Pueden incorporar más líneas de células de cáncer de vejiga o tumores vesicales primarias y células estromales adicionales como cáncer había asociado a fibroblastos y células inmunes5,6,7. Este protocolo describe una matriz compuesta de colágeno tipo 1, pero puede ser modificado para incorporar otras moléculas como la fibronectina, laminina y otras proteínas de colágeno. Procesos invasivos pueden ser seguidos durante 72 h o más dependiendo de la capacidad del microscopio y del sistema utilizado. Fijación y tinción de inmunofluorescencia de tumor embebido en la matriz 3D antes, durante y después de la invasión permite el interrogatorio de proteínas upregulated en las células invasoras, proporcionando información vital que generalmente ausente o difícil reunir usando otros modelos 3-d cultura. Este sistema también se puede utilizar compuestos de pantalla que bloquean invasión y delimitar vías de señalización afectadas por estos compuestos.
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Protocolo
1. creciente cáncer esferoides
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Crecimiento de líneas celulares
- Células de cáncer de vejiga humana cultura bajo adherente convencional condiciones de cultivo de células y mantienen en un incubador de 37 º C suministrado con 5% CO2. Mantener las células en < 90% de confluencia.
Nota: medios de cultivo utilizados es de Dulbecco modificado medio esencial mínimo (DMEM) que contiene 4,5 g/L D-glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio 110 mg/L y con 10% suero bovino fetal (FBS) a lo largo de este protocolo. - Un día antes del inicio del experimento, trypsinize (usando 0.25% tripsina-EDTA) cuantificar la concentración de células de las células y distribuir 1 x 106 células en medios de cultivo de 3 mL en cada pocillo de una placa de fijación 6-bien bajas.
- Incubar las células en condiciones de fijación baja a 37 ° C para h ≥16. Esto debe permitir suficiente tiempo para que las células a agregado en esferoides de más líneas de células de cáncer de vejiga.
Nota: La formación de esferoides puede ser observada por microscopio de campo brillante invertida. El tamaño óptimo y el número de esferoides pueden depender de experimentos individuales, pero encontramos que esferoides con un diámetro de 50 μm y 150 μm son generalmente convenientes para Time-lapse de imágenes utilizando un objetivo de 20 X. - Para incorporar los tipos de células adicionales, tales como los fibroblastos o las células inmunes en los esferoides, mezcle las celdas deseadas con células de cáncer en la proporción deseada (1:1, 1:10, etcetera.) en un accesorio ultra bajo de la placa e incubar a 37 ° C por ≥16 h permitir la formación de esferoides de tipo mezclado de la célula.
- Células de cáncer de vejiga humana cultura bajo adherente convencional condiciones de cultivo de células y mantienen en un incubador de 37 º C suministrado con 5% CO2. Mantener las células en < 90% de confluencia.
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Crecimiento de los tumores primarios
Nota: Fuentes de Tumor esferoides también pueden ser derivados del tumor primario de la vejiga tales como tumores desarrollados de inducida por el carcinógeno de la vejiga tumor modelos8. Por ejemplo, los tumores de vejiga generados a partir de ratones alimentaron con N-butil - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamina (BBN), puede ser cosechado y picado en trozos pequeños (alrededor de 0,5 mm3) utilizando instrumentos quirúrgicos estériles. Digestión primarias muestras de vejiga humana, tipos de cáncer también se pueden estudiar en este sistema.- Recoger y lavar piezas de 0.5m m3 tumor en solución fisiológica 5 mL helado con tampón fosfato (PBS). Centrifugación a 200 x g durante 5 min a 4 ° C. Repita este paso de lavado una vez.
- Recoge piezas de tumor por centrifugación a 200 x g durante 10 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y añadir 5 mL de DMEM con 10% FBS. Transferir tumor esferoide y medios mezcla a una placa de fijación 6-bien ultra baja. Incubar a 37 ° C por ≥16 h antes de la incorporación en la matriz de colágeno (ver paso 2.3).
2. preparación de la cámara de cultura 3-d
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Diluya el colágeno tipo 1 (derivado de cola de rata) en DMEM con 10% FBS para hacer una mezcla de 2 mg/mL según las instrucciones del fabricante.
- En Resumen, mezcla de colágeno con la cantidad apropiada de solución de NaOH N 1 y DMEM mediante pipeteo suave basado en las instrucciones del fabricante para alcanzar el pH fisiológico.
- Después de mezclar colágeno y DMEM, rápidamente cubrir los pozos de la diapositiva de cámara (para la mayoría de las aplicaciones, diapositivas de la cámara con un vidrio de cubierta del número 1.5 es óptimo) con la mezcla de colágeno-DMEM antes de la solidificación (200 μL/pocillo). Permita que el portaobjetos compartimiento revestido ser inmóvil a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Nota: La composición de la matriz de colágeno puede ser modificada mediante la adición de otros ingredientes de la matriz extracelular, como fibronectina o laminina, según los propósitos del experimento.
- Suavemente pipetee 500 μl de los medios de comunicación que contiene esferoides (o partes del tumor, si se utiliza la muestra de tumor primario) de la placa de fijación 6-bien ultra baja en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL vacía. Espere 2 minutos dejó de los esferoides settle al fondo del tubo.
- Retire con cuidado el sobrenadante del tubo. Preparar otro tubo de colágeno tipo 1 (2 mg/mL) mezclado con DMEM con 10% FBS y rápidamente agregar 500 μl de esta mezcla a los esferoides. Mezclar suavemente los esferoides y colágeno mediante pipeteo lento.
- Añadir 250 μl de mezcla de esferoides colágeno a un pozo de diapositivas cámara de colágeno-pre-revestida. Permitir que la matriz de colágeno que contiene esferoides que se solidifique completamente (unos 30 min a 37 ° C).
- Después de la matriz de colágeno es solidificada, agregar 1 mL de DMEM con 10% FBS a cada pozo (figura 1B). Incubar el portaobjetos de la cámara en un incubador de 37 º C suministrado con 5% CO2 hasta que esté listo para la proyección de imagen.
3. proyección de imagen de Time-lapse de la célula en vivo
- Encienda el microscopio confocal siguiendo las instrucciones del fabricante y asegúrese de que la cámara de clima llega a 37 ° C y se suministra con 5% CO2.
Nota: Nuestro microscopio y cámara generalmente requieren 1 h alcanzar el equilibrio del sistema. - Cuidadosamente transfiera el porta de la cámara para el adaptador de diapositivas conectado al microscopio.
- Localizar los esferoides de interés utilizando un objetivo de baja potencia (por ejemplo, 5 X) y comenzar la proyección de imagen con el objetivo de poder más alto (en el actual protocolo, objetivo 20 X se utiliza para la mayoría de la proyección de imagen de células vivas para su mejor calidad de imagen).
Nota: Para las muestras de tumor primario de la vejiga, 5 X y 10 X objetivos pueden ser necesarias para cubrir el área de proyección de imagen más grande. Para nuestro Time-lapse de imágenes, el intervalo de imagen se define como 30 min y una pila de Z se utiliza para el esferoide toda la imagen. Normalmente la distancia entre rodajas Z se establece a 4 μm para el 20 X objetivo y la distancia total del eje de Z es alrededor de 200 μm. las imágenes se pueden obtener utilizando DIC y con fluorescencia si las células/tejidos albergan marcadores fluorescentes. - Realizar proyección de imagen de Time-lapse de 24 – 72 h.
Nota: La duración es determinada por el tipo de célula y a las necesidades del experimento.
4. preparación del bloque de muestras que contienen esferoides de cáncer para secciones congeladas del tejido
- Levante con cuidado el bloque de gel de colágeno y esferoides de los portaobjetos de la cámara utilizando pinzas pequeñas. Colocar el bloque de gel de colágeno en un molde de plástico de la histología.
- Enjuagar el gel de colágeno con 1 x PBS brevemente y luego fijarla con 4% paraformaldehido (PFA) en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: PFA es potencial cancerígeno y debe manipularse con cuidado. - El gel de colágeno con 1,5 mL de PBS 1 x en un agitador para reemplazar a 15 minutos de lavado PBS y repita el paso anterior de lavado 3 x.
- Aplique una capa delgada (unos 3 mm) de la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto para cubrir el fondo de un molde nuevo de histología plástica. Lugar fijo y luego cuidadosamente lavado gel de colágeno en la parte superior el OCT compuesto, incrustar el gel entero llenando el molde con OCT compuesto evitando la formación de burbujas de aire en los PTU.
- Dejar el molde en 4 ° C durante 1 h.
- Coloque el molde que contiene la muestra y OCT compuesto de un plato de Petri de 100 mm flotante en nitrógeno líquido. Permita que la muestra flash-congela completamente.
- Guarde el bloque de muestras congeladas a-80 ° C para su uso futuro.
5. inmunofluorescencia imágenes para cáncer seccionado congelado esferoides
- Transferir el bloque de muestras congeladas del congelador de-80 ° C de la cámara-20 ° C de un criostato.
-
Realizar seccionamiento congelado convencional de ajuste de la sección a 7 μm. Dejó muestras seccionadas fije a la diapositiva de cristal sin arrugas o aire atrapado.
- Almacenar las diapositivas a-80 ° C antes de realizar la coloración más.
Nota: Pueden utilizarse intervalos diferentes para adaptarse a necesidades experimentales.
- Almacenar las diapositivas a-80 ° C antes de realizar la coloración más.
- Secar los portaobjetos por 1 h a temperatura ambiente.
- Permeabilizar las muestras con PBS que contenga 0,5% Tritón X-100 durante 15 minutos.
- Muestras de lavado 3 veces con PBS durante 10 minutos por lavado.
- Rodear las muestras en la diapositiva con barreras hidrofóbicas mediante el uso de la pluma de una barrera hidrofóbica.
- Tratar las muestras con solución de bloqueo (1 x PBS con 5% de albúmina sérica bovina (BSA)), por 1 h a temperatura ambiente.
- Aplican 40 μl de la solución que contiene anticuerpos primario (1 x PBS con 5% de BSA con dilución 1: 100 del anticuerpo primario) a cada muestra en la diapositiva.
- Incubar los portaobjetos en anticuerpo primario a 37 ° C por 1 h o a temperatura ambiente durante la noche (el tiempo de incubación y las condiciones varían dependiendo del anticuerpo primario).
- Muestras de lavado 3 veces con PBS durante 15 minutos (por lavado).
- Aplican 40 μl de la solución que contiene anticuerpos secundario (1 x PBS con 5% de BSA con una dilución del anticuerpo secundario de 1:300) a cada muestra en la diapositiva.
- Muestras de lavado 3 veces con PBS durante 15 minutos (por lavado).
- Mancha de las muestras con Hoechst 33342 solución 1 μg/mL, diluido en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego lavar las muestras con PBS durante 5 minutos.
- Montar las muestras con medio de montaje y cubrir con cubreobjetos de tamaños adecuado. Dejo las diapositivas en oscuridad a temperatura ambiente durante 24 h y entonces ejecutar la microscopia confocal.
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Resultados
Creación exitosa de esferoide de tumor de cáncer de vejiga invasivo requiere la formación de esferoides tumorales tamaño adecuado de líneas de células o tumores primarios. Figura 2 A muestra de tamaños adecuado esferoides desarrollados a partir de líneas de células de cáncer de cuatro vejiga humana (UM-UC9 UC13 UM, UM UC14, 253J y UM UC18). Figura 2 B muestra un tumor esferoidal de un tumor de ve...
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Discusión
Aquí describimos un modelo esferoide de tumor 3-d que permite la observación en tiempo real de invasión del cáncer de vejiga que es crítica para la metástasis y la progresión del cáncer. Este sistema es favorable a la incorporación de distintos componentes stromal y celulares para permitir a los investigadores mejor Recapitulemos el microambiente del tejido donde ocurre la invasión del cáncer de vejiga. Esferoides de cáncer de vejiga puede ser generadas de diversas fuentes como líneas celulares (incluyendo líneas celular...
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Divulgaciones
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el laboratorio del Dr. Howard Crawford (Universidad de Michigan) para el soporte técnico y proporcionando materiales y equipos para este estudio y Alan Kelleher para soporte técnico.
Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Michigan Rogel cáncer centro Core Grant CA046592-26S3, CA201335 de NIH K08-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Líneas celulares de cáncer de vejiga humana UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| Medio de cultivo celular DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific 26140079 | ||
| Antibiótico-Antimicótico (100x) | Thermo Fisher Scientific 15240062 | ||
| Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Clúster de 6 pocillos de conexión ultrabaja | Corning | 3471 | |
| Microscopio invertido convencional | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | Uso general para cultivo celular y control de esferoides |
| Colágeno tipo 1 de cola de rata, alta concentración; | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Microscopio confocal | Thermo Fisher Scientific | ||
| confocal | Carl Zeiss | LSM800 | Un miscoscopio confocal con cámara climática, imágenes de múltiples ubicaciones y función de escaneo Z-stack |
| Microtomo criostato | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Software de procesamiento de imágenes | Carl Zeiss | ||
| Solución de paraformaldehído | Ciencias de Microscopía Electrónica | 15710 | |
| ImmEdge Barrera hidrofóbica Pluma PAP | Laboratorios de vectores | Compuesto H4000 | |
| O.C.T | Thermo Fisher Scientific 23730571 | ||
| solución Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anticuerpo Anti-ATDC (Trim29) | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anticuerpo Anti-Citoqueratina 14 | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentina | anticuerpo Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Medio de montaje |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
