O9-1 es una línea de células de cresta neural ratón pluripotentes. Aquí describimos protocolos detallados paso a paso para cultivar células O9-1, diferenciar células O9-1 hacia tipos celulares específicos y manipular genéticamente las células O9-1 mediante caída mediada por siRNA o CRISPR Cas9 edición del genoma.
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Artículo de método
Cultivo y manipulación de células de la cresta Neural O9-1
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Resumen
Resumen
Las células de la cresta neural (NCCs) están migrando las células madre pluripotentes que pueden diferenciarse en diversos tipos celulares y dar lugar a múltiples tejidos y órganos. La línea celular O9-1 se deriva de la endógena NCCs embrionaria del ratón y mantiene su multipotencia. Sin embargo, bajo condiciones de cultivo específicas, O9-1 células pueden diferenciarse en diversos tipos celulares y ser utilizadas en una amplia gama de aplicaciones de investigación. Recientemente, con la combinación de estudios con ratones y estudios del O9-1 celular, hemos demostrado el hipopótamo señalización efectores vía Yap y Taz desempeñan papeles importantes en el desarrollo craneofacial derivado de cresta neural. Aunque el proceso de cultivo de células O9-1 es más complicado que para otras líneas celulares, la línea celular O9-1 es un potente modelo para la investigación de NCCs in vitro. Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de la línea celular de O9-1 para mantener su troncalidad, así como protocolos para diferenciar las células O9-1 en diferentes tipos celulares, como las células musculares lisas y los osteoblastos. Además, se describen los protocolos para realizar estudios de pérdida de función del gene en células O9-1 mediante eliminación de Cas9 CRISPR y caída de mediada por RNA interferente pequeños.
Introducción
Las células de la cresta neural (NCCs) son células madre multipotentes con una notable capacidad migratoria y existencia transitoria durante el desarrollo embrionario. NCCs se originan entre el ectodermo superficial y el tubo neural y migran a otras partes del embrión durante el desarrollo embrionario1. Basado en sus dominios funcionales, NCCs pueden clasificarse en varios tipos, incluyendo craneal, tronco, vagal, sacro y cardiaca NCCs. Además, la NCCs pueden diferenciarse en varios linajes celulares, como las células musculares lisas, células óseas y las neuronas y dan lugar a diferentes tejidos2,
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Protocolo
1. preparación antes de cultivo celular O9-1
Nota: Basal medios utilizados para el cultivo celular de O9-1 deben han sido condicionados por Sandos endogámicas ratones tioguanina ouabain-resistente (STO) fibroblastos células de ratón; por lo tanto, las células STO necesitan ser obtenidos y preparado como se describe a continuación antes de iniciar el cultivo de células O9-1.
-
Cultura de célula activa de STO
- Preparar medios de cultivo de células activas de STO haciendo completa Dulbecco modificado media del águila (DMEM) y 7% de suero bovino fetal (FBS) (grado de cultura de células madre embrionarias), 100....
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Resultados
El objetivo de nuestros experimentos de caída y golpe de gracia fue estudiar los efectos de Yap y Taz pérdida-de-función en células O9-1. Antes de los experimentos de precipitación y golpe de gracia, tenemos que asegúrese de que preparar para los medios basales y células en cultivo O9-1 como se describe anteriormente (por ejemplo, la membrana del sótano matriz necesidades para cubrir la placa entera como se muestra en la figura 1y las célula.......
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Discusión
El NCC es un versátil y clave a diferentes tejidos y órganos durante la morfogénesis embrionaria. La línea celular O9-1 mantiene su potencial para diferenciarse en muchos tipos de células diferentes y simula las características en vivo de la NCCs, convirtiéndolo en una herramienta útil en vitro para estudiar la función génica y regulación molecular de la NCCs. Del estado diferente de células O9-1 puede corresponder a diferentes nervios de la cresta progenie en vivo, dependiendo de las condicion.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nicole Stancel, pH.d., ELS, de publicaciones científicas en el Instituto del corazón de Texas, proporcionó apoyo editorial. También agradecemos a las siguientes fuentes de financiación: subvención de desarrollo de la American Heart Association nacional centro científico (14SDG19840000 a J. Wang), el Premio de investigación Lawrence de 2014 de la Rolanette y Berdona Lawrence hueso enfermedad programa de Texas (a J. Wang ) y los institutos nacionales de salud (DE026561 y DE025873 J. Wang, DE016320 y DE019650 a R. Maxson).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células alimentadoras de STO activas | ATCC | ATCC CRL-1503 | También disponible en forma inactivada por mitomicina C, catálogo # Línea celular de |
| cresta neural craneal de ratón | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, alto en glucosa, sin glutamina | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, alto contenido de glucosa | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (suero fetal bovino) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicilina - estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatina de piel porcina | Sigma | G1890 | |
| Tripsina-EDTA 0,25% en HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) sin calcio o magnesio | Lonza | 17-512F | |
| MEM aminoácidos no esenciales (MEM NEAA) 100Xx | Gibco | 11140-050 | |
| Piruvato de sodio (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO factor inhibidor de la leucemia (LIF) 106 unidad/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Factor de crecimiento de fibroblastos humanos recombinante-básico (rhFGF-básico) | R& D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomicina C | Roche | 10107409001 | |
| matriz Matrigel | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimetilsulfóxido) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamina RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1x) | Gibco | 31985-070 | |
| Medio esencial mínimo, alfa 1x con sales de Earle, ribonucleósidos, desoxirribonucleósidos, & L-glutamina | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (suero fetal de ternero) | |||
| ITS (insulina-transferrina-selenio) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ácido | |||
| BMP2 (proteína morfogenética ósea 2) | |||
| Suplemento | |||
| B-27 |
Referencias
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
