Un método automatizado para determinar el rendimiento de Drosophila en respuesta a cambios de temperatura en el espacio y el tiempo

Temperatura es un factor ambiental constante que afecta a cómo funcionan y comportan¹organismos. Las diferencias en latitud y altitud conducen a diferencias en el tipo de organismo están expuestos, que resulta en la selección evolutiva de sus respuestas a^2,de temperatura³climas. Los organismos responden a diferentes temperaturas, a través de adaptaciones morfológicas, fisiológicas y conductuales que maximizan el rendimiento de sus entornos particulares⁴. Por ejemplo, en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, poblaciones de diferentes regiones tienen preferencias de temperatura diferentes, tamaños de cuerpo, tiempos de desarrollo, longevidad, fecundidad y rendimiento a pie a diferentes temperaturas^{2 ,5,6,7}. La diversidad observada entre moscas de diferentes orígenes se explica en parte por la variación genética y expresión de gene de plástico^8,9. Asimismo, especies de Drosophila de diferentes áreas distribuyen diferentemente entre gradientes de la temperatura y muestran diferencias en la resistencia al calor extremo y frío pruebas^10,11,12.

Drosophila se ha convertido recientemente en el modelo de elección para entender las bases genéticas y de los nerviosas de temperatura percepción^{13,14,15,16,17}. En términos generales, moscas adultas perciben temperatura mediante sensores de temperatura periférica frío y caliente en las antenas y sensores de temperatura en el cerebro^{13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20}. los receptores de la periferia para temperaturas expresan Gr28b.d¹⁶ o pirexia²¹, mientras que la periferia receptores fríos se caracterizan por Brivido¹⁴. En el cerebro, temperatura es procesada por neuronas expresan TrpA1¹⁵. Estudios de comportamiento en mutantes de estas vías están mejorando nuestra comprensión de cómo se procesa la temperatura y dan penetraciones en los mecanismos que varían entre las poblaciones de Drosophila de diferentes regiones.

Aquí describimos una arena con control de temperatura que produce cambios de temperatura rápida y precisa. Los investigadores pueden programar previamente estos cambios, que permite manipulaciones estandarizada y repetible de la temperatura sin intervención humana. Moscas se registran y se realiza un seguimiento con software especializado para determinar su posición y la velocidad en diferentes fases de un experimento. La principal medición presentada en este protocolo es la poca velocidad a diferentes temperaturas, ya que es un índice ecológico relevante de rendimiento fisiológico que puede identificar adaptabilidad térmica individual⁵. Junto con mutantes del receptor de temperatura, esta técnica puede ayudar a revelar los mecanismos de adaptación térmica a nivel celular y bioquímico.

1. preparación de alimentos mosca medio

1. Verter 1 L de agua del grifo en un vaso de precipitados de vidrio de 2 L y añada una barra de agitación magnética. Poner el vaso en una placa magnética a 300 ° C hasta que se alcanza la temperatura de ebullición.
2. Revuelva a 500 rondas por minuto y agregue lo siguiente: 10 g de agar, 30 g de glucosa, 15 g de sacarosa, 15 g de harina de maíz, 10 g de germen de trigo, 10 g de harina de soja, 30 g de melaza y 35 g de active levadura seca.
3. Cuando la mezcla hace espuma vigorosamente, baje la temperatura de la placa caliente a 120 ° C manteniendo agitación.
4. Girar a la temperatura de la placa más hasta 30 ° C después de 10 min y continuar revolviendo hasta que la mezcla se haya enfriado a 48 ° C. Medir la temperatura introduciendo un termómetro directamente en la comida sin tocar las paredes del vaso.
5. Disolver 2 g de ésteres metílicos de ácidos p-hidroxi-benzoico en 10 mL de etanol al 96% y añadir a la mezcla, junto con 5 mL de ácido propiónico de 1 M. Seguir revolviendo durante 3 minutos.
6. Apague la placa caliente y vierta 45 mL de alimento en la cría botellas y 6,5 mL de alimentos en los frascos de colección.

2. preparación de las moscas

1. Lugar 20 varones y 20 mujeres vuela en las botellas de crianza que contiene 45 mL de medio de alimentos mosca. Transferir las moscas a las botellas de nuevo después de 3 a 4 días golpeando hacia abajo y luego aprovechando las botellas frescas. Deseche las moscas después de tres cambios.
   1. Colocar las botellas dentro de la incubadora bajo ciclos oscuros de 12 h luz/12 h con una temperatura constante de 25 ° C.
      Nota: Una nueva generación de moscas le eclose después de diez días.
2. Anestesiar nuevamente moscas eclosed de almohadillas de dióxido de carbono para un máximo de 4 minutos y recoger en mosca viales cría 2.5 x 9.5 cm con 6,5 mL de medio de alimentos mosca con un pincel.
   1. Recoger sólo Virgen moscas y separarlos por sexo en grupos de 20 moscas por frasco de cría.
   2. Colocar los frascos dentro de incubadoras durante 5-7 días, cambiando las moscas a viales nuevos cada 2-3 días y en los días antes de los experimentos.

3. marco de luces

1. Hacer un marco de madera de 10 cm de longitud, 4 cm de ancho, altura 4 cm y 0,5 cm de espesor.
2. En cada uno de los bordes cortos, crear un borde de 4 cm de longitud, 4 cm de altura y 1,5 cm de ancho hacia el interior área de la estructura de madera. Deja la cara interna de la frontera abierta.
3. Taladre dos orificios de 0,5 cm de diámetro en la intersección de uno de los bordes laterales de la estructura de madera y en cada una de las fronteras en los bordes cortos.
4. Lugar de 10 cm de una tira de LED blanco cálida dentro de cada una de las fronteras en los bordes cortos. Pele la parte posterior de la tira de LED para encolarla inmediatamente.
   Nota: Para los experimentos en que la iluminación se debe eliminar, puede sustituirse la tira de LED blanco cálida LED infrarrojo tiras.
5. Conecte un extremo de la tira de LED en una de las fronteras a la fuente de alimentación conmutada y su otro extremo a la tira de LED en el borde opuesto.
6. Encienda la fuente de alimentación conmutada para verificar que ambas tiras de LED se encienda.
7. Cubra el lado abierto de cada borde con un trozo blanco de papel.
8. Pegar otro trozo de papel a cada una de las fases internas de los bordes laterales.

4. control de temperatura de la Arena

1. Encienda la arena con control de temperatura (figura 1A y 1C). Asegúrese de que el ventilador comienza a funcionar y el anillo de aluminio comienza a calentar.
2. Utilice un cable USB para conectar la arena con control de temperatura para la computadora de control, ejecutar el script TemperaturePhases con las secuencias de la temperatura.
3. Abrir el script TemperaturePhases en la computadora de control y verificar que la secuencia de temperatura está configurada correctamente (Video 1).
   1. Comprobar que la duración de cada fase experimental se establece en 60 s verificando que "par. StimulusDur"es igual a 60 s.
   2. Compruebe que el número 1) igual al número de fases, 2) iterativas ON/OFF ajuste de la luz roja indica diodos (LEDs), aumento de la temperatura del ° C 3) 2 por fase, deseado y 4) 16 ° C como temperatura inicial todo correcto debajo de "Inicio de la experimental sección del bloque".
      Nota: Deje que las moscas se adapte a la Arena vuela por 7 min a 16 ° C para evitar un aumento artificial de la velocidad durante las primeras fases experimentales (figura 2).
   3. Ejecute el script TemperaturePhases . El software se inicializa durante 5 segundos como en "arena. Wait"y luego stop.
   4. Presione la barra espaciadora del teclado para empezar a correr las fases experimentales una vez que una mosca se ha fundido en la Arena de la mosca (paso 5.3).
      Nota: El TemperaturePhases es el script actual control de la caja; sin embargo, es posible crear otros scripts personalizados para utilizar este dispositivo que se ajustan a los requisitos de diferentes experimentos.
4. Conecte la cámara encima de la arena para el equipo de grabación usando el cable USB de la cámara.
5. Abrir el programa de grabación de vídeo (véase Tabla de materiales) en el equipo de grabación seleccionando "archivo | Nueva grabación de película". Se abrirá una pantalla que muestra la imagen de la cámara.
   1. Asegúrese de que la imagen de la cámara capta todos los bordes de la arena y el LED rojo indicativo.
   2. Iniciar la grabación pulsando el botón rojo en medio del borde inferior de la pantalla que muestra la imagen una vez que el cuadro de luces se encuentra alrededor de la arena (paso 5.4).
      Nota: pequeños cambios en la iluminación puede afectar la precisión de seguimiento. Se recomienda para mantener la iluminación del recinto de control de temperatura constante mediante la fijación de la ubicación del aparato.

5. temperatura experimentos conductuales

1. Preparar la Arena mosca (figura 1).
   1. Colocar un filamento de cinta conductora blanca en la parte superior de las baldosas de cobre, asegurando que cubrir todos los bordes.
   2. Coloque el anillo de aluminio calentado alrededor de las baldosas de cobre. El borde del anillo encaja perfectamente en las baldosas de cobre por lo que siempre se coloca en el mismo lugar.
   3. Limpie la cubierta de vidrio con un paño limpio y colóquelo en la parte superior del anillo de aluminio, dejando un espacio a través del cual puede soplarse en una mosca.
      Nota: Antes de los experimentos, capa de la cubierta de vidrio con el agente siliconado para crear una superficie resbalosa. Aplique al agente siliconado para 24 horas y enjuagar con agua antes de usarla.
2. Ejecute el script TemperaturePhases (paso 4.3.3) y abrir el programa de grabación de vídeo (paso 4.5).
3. Volar la mosca de un frasco de cultivo (paso 2.2.2) en la mosca de Arena (por ej., 1 hombre volar en la figura 3).
   1. Tomar un frasco de las moscas de la incubadora, púlselo dos veces para obligarlos a ir a la parte inferior, atrapar una mosca con un aspirador de boca y cerrar el frasco y lo pones de nuevo en la incubadora.
   2. Colocar la mosca en la arena el espacio que ha quedado entre la tapa de cristal y anillo de aluminio (paso 5.1.3).
   3. Cerrar la brecha entre la cubierta de cristal y anillo de aluminio empujando la tapa de vidrio hasta que alcance el borde del anillo de aluminio como la mosca se introduce a la mosca de Arena.
4. Coloque el marco de luces alrededor de la arena para iluminación simétrica.
   1. Marque la ubicación (por ej., usando un marcador permanente) del cuadro de luces alrededor de la Arena de volar (figura 1) para asegurar que el marco se coloca siempre en el mismo lugar.
5. Iniciar la grabación con el programa de grabación de vídeo (paso 4.5.2) y presione la barra espaciadora en el teclado de la computadora de control para comenzar a correr las fases experimentales (paso 4.3.4).
6. Fases experimentales después de todo se hacen, guardar el video en formato. MP4 o .avi y eliminar la mosca de la Arena vuela con el aspirador de boca.
   Nota: Al final de las fases experimentales se puede determinar por ambos LED rojo indicativo sea apagado o por la detención de secuencia de comandos TemperaturePhases .
   1. Detener el grabación presionando el botón de parada en medio del borde inferior de la pantalla en el programa de grabación de vídeo. Presione "archivo | Guardar como"para guardar el video.

6. vídeo de seguimiento y análisis de datos

1. Utilizar FlySteps (Video 2) el software de seguimiento para los videos.
   1. Abrir el "configuration_file.ini" dentro de la carpeta "FlyTracker".
   2. Establecer la ubicación de los vídeos de "video_folder" y los nombres de los vídeos de "video_files".
   3. Especificar las fronteras de la Arena vuela en "arena_settings" basado en (x, y) coordenadas de píxeles de varios puntos en el borde de la arena.
   4. Especificar la ubicación de los LED rojo indicativos en "led_settings" basado en (x, y) coordenadas de píxel de la ubicación del centro de los LEDs.
   5. Compruebe la ubicación de las fronteras de la mosca de Arena mediante el establecimiento de "debug" a "true" en "arena_settings", clic en "Guardar" y ejecutar el script en la terminal. Una captura de pantalla del video aparece con un cuadrado azul formado por las coordenadas introducidas en "arena_settings".
      Nota: Esta plaza rodea la zona para realizar un seguimiento.
   6. Cambiar "debug" en "arena_settings" a "false", haga clic en "Guardar" y ejecutar la pantalla en el terminal una vez más.
      Nota: Con esto iniciará el proceso de seguimiento.
      Nota: Moscas pueden caminar fuera del área de seguimiento a la anilla de aluminio caliente. Esto ocurre durante los primeros segundos de un experimento, después de lo cual moscas dejará de tocar el anillo caliente y permanecen dentro del área de seguimiento.
      Nota: Los Videos pueden ser rastreados con otro software de seguimiento de acuerdo a las preferencias del experimentador.
2. Uso (x, y) la ubicación de cada mosca que proporciona el software de seguimiento para calcular la medida de interés para el funcionamiento de la temperatura. Scripts personalizados (e.g., FlyStepsAnalysis en complementario) puede ser utilizado.
3. Comparar las curvas de rendimiento de la temperatura de los diferentes grupos de moscas utilizando análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas (MR) y post-hoc de comparaciones múltiples utilizando el software estadístico (véase Tabla de materiales).

El ámbito de control de temperatura (figura 1A) se compone de tres naipes de cobre cuya temperatura puede ser controlada individualmente a través de un circuito programable. Cada azulejo de cobre posee un sensor de temperatura que da retroalimentación al circuito programable. El circuito activa una fuente de alimentación para aumentar la temperatura de cada azulejo. Elementos termoeléctricos pasivos actúan como elementos de calefacción constante para mantener la temperatura deseada, mientras que un disipador de calor enfriado por un ventilador de enfriamiento constante. La magnitud del cambio de temperatura determina la velocidad del proceso de una manera no lineal. Sólo requiere un aumento de 2 ° C 0.1 s y un aumento de 18 ° C requiere 4 s. Una pantalla conectada al circuito programable (figura 1) informa al usuario de la temperatura medida por los sensores de temperatura en cada uno de los azulejos. Las baldosas de cobre están rodeadas por un anillo de aluminio constantemente calentado a 50 ° C (figura 1B y 1C) por semiconductores alrededor de la periferia. Este anillo forma los bordes de la Arena vuela (figura 1), la zona en la que las moscas son para colocarse. La Arena de la mosca está cubierta por una cubierta de vidrio siliconado (figura 1A y 1C), que proporciona un espacio alto y 3 mm que asegura que vuela puede caminar pero no volar. Junto a la Arena de la mosca son dos LEDs rojos (figura 1) que pueden programarse para marcar diferentes fases experimentales. Por ejemplo, los resultados se muestra en la figura 2A, cada LED está asociada con una temperatura distinta, mientras que en la figura 2B, cada LED indica 60 s. El software de FlySteps puede registrar cuando cada uno de los LED indicativos, y el investigador puede utilizar esta información para determinar automáticamente las fases experimentales basadas en la temperatura o el tiempo.

El ámbito de control de temperatura puede utilizarse para comparar la respuesta de comportamiento de moscas de diferentes orígenes genéticos a cambios de temperatura dinámica. Por ejemplo, moscas de diferentes especies pueden estar expuestos al poco a poco aumento de la temperatura (figura 3) para comparar las diferencias en el rendimiento térmico. La velocidad de todas las especies aumenta a medida que aumenta la temperatura hasta llegar a un punto de máximo rendimiento, después de lo cual decayó y murió. Sin embargo, cada especie tiene una curva de respuesta particular con velocidades de respuesta máxima específica y tolerancia térmica. Informes anteriores han demostrado que Drosophila de diferentes especies difieren entre el momento del desarrollo, longevidad, fecundidad, dimensiones del cuerpo, comunicación sexual y temperatura tolerancia3,6,7 ,8,22. Así pues, nuestra descripción de locomoción propios de cada especie en un gradiente de temperatura agrega a este cuerpo de trabajo.

El ámbito de control de temperatura puede utilizarse también para explorar la respuesta a los experimentos basados en temperatura de acondicionamiento. La forma más simple de este enfoque es un paradigma de condicionamiento operante en que entrenan a los moscas a preferir un lado de la arena sobre el otro, calentando la parte que será evitado23,24,25. Nos expuestos a moscas individuales a 40 ° C en el medio y uno de los azulejos laterales, dejando el otro lado azulejo en un cómodo 22 ° C (figura 4). El salvaje-tipo vuela detenido a lo largo de la arena y permaneció en el lugar cómodo rápidamente. Por el contrario, el mutante de memoria clásico burro mantuvo explorando la arena y pasó menos tiempo que los controles en la ubicación cómoda. Las diferencias entre el funcionamiento de las moscas de tipo salvaje y mutantes de burro llegó a ser más grandes cuando todas las fichas estaban resueltos a 22 ° C y se realizaron comparaciones entre los grupos de tratamiento. Mutantes de burro también mostraron mayores diferencias entre las fases de entrenamiento y test en comparación con las moscas del tipo salvaje (figura 4). Estos resultados sugieren un efecto de memoria en permanecer en el lugar cómodo.

Combinaciones de temperatura y ubicación también son útiles para entender la función de los receptores de temperatura durante los cambios de temperatura dinámica. Hemos expuesto individuales mutantes de D. melanogaster Gr28b.d y TrpA1GAL4 para aumento de la temperatura (aumento de 2 ° C cada 60 s) mientras que proporciona un lugar cómodo a 22 ° C (figura 5). La cómoda ubicación cambió de izquierda a derecha y viceversa, por iteración. Los resultados muestran que los mutantes de Gr28b.d periferia temperatura del receptor se comportan como el control, ya que pasan más tiempo en el lugar cómodo como aumentos de temperatura. Sin embargo, cerebro temperatura del receptor TrpA1GAL4 mutantes no es afectada por el aumento de la temperatura y no cambia sus ubicaciones en la arena. Los aumentos y disminución en la curva de TrpA1GAL4 mutantes muestran el efecto en moscas que ya estaban sentados en el lugar cómodo antes de convertirse en cómodo y permaneció allí durante esa fase. La consistencia de picos y valles de la curva de TrpA1GAL4 sugieren que estas moscas sigue siendo todavía para la mayoría de la experiencia; por lo tanto, constantemente se contaron cuando su ubicación era el considerado cómodo. Esta conclusión fue confirmada por la inspección visual de los vídeos grabados. Estos resultados apoyan anteriores fisiológicas informes sugiriendo esa percepción de la periferia de grandes y rápidos cambios no depende de Gr28b.d17 y que las moscas poseen un mecanismo central principal a temperatura del sentido basado en TrpA1 14,21.

Figura 1: Diagrama de temperatura controlada-arena. (A) vista lateral de la arena con control de temperatura. Un circuito programable conecta un sensores de temperatura y suministro de potencia con resistencias bajo tejas de cobre para controlar su temperatura. Los azulejos se enfrían constantemente a través de un disipador de calor conectado a un ventilador. Un anillo de aluminio calentado sobre la cual descansa una cubierta de cristal rodea los azulejos. (B) termográfica que muestra las fichas de 24 ° C (arriba) y azulejos de lado a 24 ° C con una media baldosa a 30 ° C (inferior). (C) una visión superior de la arena. Una cámara registra la baldosas cobre, anillo de aluminio y LED ' s rojos, entonces automáticamente determina fases experimentales. Una pantalla en la esquina de la caja, no registrada por la cámara, muestra la temperatura actual del azulejo. (D) anillo de la luz: dos tiras de LED blanco cálidas dentro de una caja de madera cubierto de papel blanco aseguran iluminación constante y simétrica de la arena entera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: moscas deben aclimatarse a la arena antes de iniciar el protocolo de la temperatura. (A) moscas macho solos fueron introducidos a la arena y permite explorar en una constante de 16 ° C por 1 min, después de que la temperatura comenzó a aumentar. (B) solo moscas expuestas a 16 ° C, 20 ° C y 24 ° C (sin diferencias de grupo; F ANOVA dos vías (2.570) = 4.156, p = 0.162) tienen una mayor locomoción al principio del experimento que después de 5 minutos (F de ANOVA de dos vías RM (9.570) = 7.803, p < 0.0001). Los datos son la media y error estándar de la media (± SEM) de las moscas hembra Virgen 20 5 a 7 días de edad probado sobre varios días. Asterisco indica diferencia significativa entre grupos (*** p < 0.0001; Tukey de prueba de comparación múltiple, p = 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Locomoción de 5 especies de Drosophila expuesta a aumentando poco a poco las temperaturas. Hombre individual vuela desde templado tropical (azul), (rojo) y cosmopolita especie de Drosophila (marrón) fueron expuesto a un gradiente de aumento de temperatura (2 ° C cada 60 s) entre 16 y 46 ° C. Los primeros 7 min fueron constantemente a 22 ° C permitir que vuela explorar la arena. Especies fueron significativamente diferentes (F(4,70) de ANOVA de dos vías RM = 28.46, p < 0.001). (a) D. melanogaster (marrón; lleno de círculos) era más rápido cuando introdujo en la arena. (b) D. Plaza (rojo; vaciar plazas) era más rápido aumento de la temperatura. (c) D. suzukii (marrón; cuadrado relleno) fue más lento que las otras moscas cosmopolitas en su punto de máximo rendimiento. (d) D. simulans (marrón; vaciar círculos) estaba en decadencia en el punto máximo de D. melanogaster. Cada punto representa la media (± SEM) de las moscas macho 15 5 a 7 días de edad probados durante varios días. Significado indicado por símbolos (♦ = diferencia de todos, p < 0.0001; † = diferencia de todos excepto la D. melanogaster, p < 0.0001; • = diferencia de D. melanogaster, p < 0.01; ¢ = diferencia de D. melanogaster, p < 0.001; = diferencia entre grupos con nombre, p < 0.0001; Tukey de prueba de comparación múltiple, p = 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: el ámbito de control de temperatura puede ser utilizado para el condicionamiento operante. Cepa de Cantón-S D. melanogaster (tipo salvaje; negro frontera) y dnc1 (burro; borde rojo) mutantes fueron entrenados para preferir un azulejo lateral a 22 ° C después de calentar el medio y frente a los azulejos laterales a 40 ° C durante 4 min (formación, no patrón). Memoria de las áreas calentadas y luego se prueba poniendo todas las fichas a 22 ° C (prueba; cuadrícula). Moscas se acondicionaron a preferir baldosas a la izquierda en la mitad de los experimentos, entonces los azulejos a la derecha en la otra mitad. Se midió el porcentaje de tiempo total en el azulejo a 22 ° C durante la formación y pruebas para comparar actuaciones. Grupos fueron significativamente diferentes (F(3,76) ANOVA unidireccional = 23.23, p < 0.0001), con burro realizar peor tipo salvaje en general. Los datos son la media (± SEM) de las moscas hembra Virgen 20 días 5 a 7 pruebas durante varios días. Los asteriscos indican diferencias de significación entre los grupos (*** p > 0.0001; *** p > 0,001; ** p > 0.01; Tukey de prueba de comparación múltiple, p = 0.05) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: respuesta de mutantes de temperatura al aumentar la temperatura cuando se proporciona una ubicación cómoda. Mutantes de temperatura Gr28b.d (verde; plazas) responden como controles (w1118, negro, círculos) incrementando el porcentaje de tiempo en la zona cómoda como aumentos de temperatura (F de ANOVA de dos vías RM (1,38) = 0.5107, p = 0.479). Mutantes de TrpA1GAL4 (amarillo; triángulos) son diferentes de los controles (w1118negro), como no aumentar el tiempo en la zona cómoda como aumentos de temperatura (F de ANOVA de dos vías RM (1,38) = 1.670, p = 0.019). Los datos son la media (± SEM) de 20 moscas macho probados durante varios días de edad de 5 a 7 días. TrpA1GAL4 es significativamente diferente de Gr28b.d y el control (p < 0.05; Tukey de prueba de comparación múltiple, p = 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.