Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

Resumen

Una placa de imagen basado en el HMCA se presenta para el funcionamiento de ensayo de invasión. Esta placa facilita la formación de esferoides tumorales (3D) tridimensional y la medición de la invasión de células de cáncer en la matriz extracelular (ECM). La cuantificación del ensayo de invasión se logra por análisis semiautomático.

Resumen

Metástasis del cáncer se sabe que causan el 90% de mortalidad de cáncer. La metástasis es un proceso gradual que inicia con la penetración/invasión de células tumorales en el tejido vecino. Así, la invasión es un paso crucial en metástasis, haciendo la investigación del proceso de invasión y desarrollo de fármacos anti-metastásicos, altamente significativo. Para hacer frente a esta demanda, es necesario desarrollar modelos 3D en vitro que imitan la arquitectura de tumores sólidos y su microambiente más cerca a estado en vivo en una mano, pero al mismo tiempo ser reproducibles, robusta y conveniente para alto rendimiento y alto contenidas mediciones. Actualmente, la mayoría ensayos de invasión apoyan en tecnologías de microfluidos sofisticados que son adecuadas para la investigación pero no para la detección de drogas de alto volumen. Otros ensayos utilizando dispositivos basados en placa con esferoides individuales aisladas en cada pozo son material consumo y tamaño de la muestra baja por condición. El objetivo del protocolo actual es proporcionar un sistema de celulares 3D de biomiméticos simples y reproducibles para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Se desarrolló un modelo 3D para análisis de invasión basado en la placa de proyección de imagen de HMCA para la investigación de invasión del tumor y descubrimiento de fármacos anti-metastásico. Este dispositivo permite la producción de numerosos esferoides uniforme por pocillo (tamaño de la muestra alta por condición) rodeada por los componentes del ECM, mientras continuamente y al mismo tiempo observando y midiendo los esferoides en el solo elemento de resolución por medio proyección de producción de drogas anti-metastásicas. Esta plataforma se presenta aquí por la producción de HeLa y MCF7 esferoides para ejemplificar unicelular y la invasión colectiva. Comparar la influencia de la ECM componente el ácido hialurónico (HA) en la capacidad invasiva de colágeno que rodean esferoides de HeLa. Por último, no presentamos Fisetin (inhibidor de la invasión) HeLa esferoides y óxido nítrico () (activador de invasión) a MCF7 esferoides. Los resultados son analizados por el software interno que permite el análisis semi-automático, simple y rápido que facilita el examen de múltiples parámetro.

Introducción

Muerte por cáncer se atribuye principalmente a la difusión de las células metastásicas a lugares distantes. Muchos esfuerzos en el tratamiento del cáncer se centran en objetivos o impedir la formación de colonias metastásicas y progresión de la enfermedad metastásica sistémica¹. Migración de la célula de cáncer es un paso crucial en el proceso de metástasis de tumor, por lo tanto, la investigación de la cascada de invasión del cáncer es muy importante y un requisito previo a la búsqueda de terapias anti-metastásico.

El uso de modelos animales como herramientas para el estudio de enfermedad metastásica se ha encontrad....

Protocolo

1. HMCA placa repujado

Nota: El proceso completo para el diseño y fabricación de sello de polidimetilsiloxano (PDMS) y HMCA imagen usada en este protocolo se describe en detalle en nuestros anteriores artículos^15,16. El sello PDMS (forma negativa) se utiliza para realzar el HMCA (forma positiva) que consiste en aproximadamente 450 MCs por pozo (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, cada uno de los MCs tiene forma de una pirámide truncada de forma cuadrada boca abajo (altura: 190 μm, pequeña base: 90 μm μm x 90 y gran á....

Resultados

El único HMCA placa de la proyección de imagen se utiliza para el ensayo de invasión de esferoides tumorales 3D. El ensayo completo, comenzando con la formación esferoide y terminando con el proceso de invasión y manipulación adicional, se realiza en el mismo plato. Para la formación esferoide, células HeLa se cargan en la cuenca de la matriz y se instalan en el hidrogel MCs por gravedad. El hidrogel MCs, que tienen características de adherente/bajo sujeción, facilitar la interacción célu.......

Discusión

Está bien documentado que los organismos vivos, caracterizados por su compleja organización multicelular 3D son muy distintos de las células de la monocapa 2D utilizados cultivada, haciendo hincapié en la crucial necesidad de utilizar modelos celulares que mejor imitan las funciones y procesos de un organismo vivo para drogas. Recientemente, esferoides multicelulares, culturas organotypic, organoides y órganos-en-un-chip han sido introducidas⁸ para el uso en el descubrimiento de fármacos estandari.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
6 placas inferiores de vidrio de micropocillos con cubreobjetos de micropocillo de 14 mm #1.5	Cellvis	P06-14-1.5-N	Placas inferiores de vidrio comerciales que se utilizan para el estampado de HMCA
Invitrogen de	bajo punto de fusión UltraPure	16520100	Una solución de agarosa al 6% se calienta hasta 80 & grados; C antes de usar, se calienta una solución de agarosa al 1% a 37 & grados; C
Tripsina EDTA solución B	Industrias Biológicas	03-052-1A	Calentado a 37 ° C antes de usar
DMEM medio, glucosa alta	Biological Industries	01-055-1A	Calentado a 37 ° C antes de usar
Suero especial para terneros recién nacidos (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	DPBS inactivado por calor
(10x), sin calcio, sin magnesio	Biological Industries	02-023-5A	Mantenido en hielo antes de usar
NaOH, anhidro	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Se utiliza para la preparación de una solución de NaOH 1 M
Colágeno Cultrex Tipo I de cola de rata, 5 mg/mL	Trevigen	3440-100-01	Mantener en hielo antes de usar
Sal sódica de ácido hialurónico	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Mantener en hielo antes de usar
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Añadido al medio de cultivo, inhibidor de invasión
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Añadido al medio de cultivo, donante de óxido nítrico
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Se utiliza a una concentración muy baja sin necesidad de lavar el
sistema completo de la lámpara de inundación UV Dymax 5000-EC con escudo de luz y Fuente de alimentación Dymax EC de 400 vatios	Dymax Corporation	PN 39823	Se utiliza para la esterilización de placas HMCA mediante
microscopio UV IX81 invertido	Olympus		Se utiliza para la adquisición automática de imágenes
Incubadora para microscopio	Life Imaging Services		Esencial para experimentos de lapso de tiempo con adquisición de imágenes, preajustado a 37 ° C, 5% CO2 y mantener una atmósfera humidificada
Platina motorizada submicrónica tipo SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Se utiliza para predeterminar áreas de adquisición de imágenes, para la adquisición automática
de imágenes Cámara refrigerada ORCA II C4742-98 de 14 bits	Hamamatsu Photonics		Altamente sensible, utilizado para la obtención de imágenes
Cubo de filtro fluorescente para la detección de PI	Corporación de Tecnología Chroma		Especificaciones del cubo de filtro: filtro de excitación 530-550 nm, espejo dicroico 565 nm paso largo y filtro de emisión 600-660 nm
El software operativo Olympus Cell^P	Software Olympus		utilizado para controlar el microscopio, la platina motorizada, la cámara y la adquisición de imágenes
Software de análisis Matlab R2014B	Mathworks		Se utiliza para desarrollar una interfaz gráfica de usuario interna para el análisis de imágenes
Software	ExcelMicrosoft		Se utiliza para la gestión de datos, el cálculo, la creación de gráficos y las estadísticas

Agarosa