El protocolo describe intubating pez cebra adulto con un biológico; disección y preparación del intestino para microscopía confocal, citometría y qPCR. Este método permite la administración de compuestos bioactivos para controlar la absorción intestinal y el estímulo inmunológico local evocada. Es relevante para la dinámica intestinal de profilaxis orales de la prueba.
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Artículo de método
Intubación por vía oral de pez cebra adulto: un modelo para evaluar la absorción Intestinal de compuestos bioactivos
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Resumen
Resumen
La mayoría de patógenos invadirán organismos a través de su mucosa. Esto es particularmente cierto en los peces que están continuamente expuestas a un ambiente de agua rica en microbios. Desarrollo de métodos efectivos para la administración oral de inmunoestimulantes o vacunas, que activan el sistema inmunológico contra las enfermedades infecciosas, es altamente deseable. Al idear herramientas profilácticas, se necesitan buenos modelos experimentales para probar su funcionamiento. A continuación, os mostramos un método para la intubación por vía oral de pez cebra adulto y un conjunto de procedimientos para disecar y preparar el intestino para citometría, microscopia confocal y análisis de (qPCR) la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Con este protocolo, precisamente podemos administrar volúmenes hasta 50 μL para pescar aproximadamente 1 g de peso sencilla y rápida, sin dañar los animales. Este método nos permite explorar la absorción directa en vivo de fluorescencia con compuestos por la mucosa intestinal y la capacidad inmunomoduladora de estos productos biológicos en el sitio local después de la intubación. Combinando métodos aguas abajo como histología, qPCR, citometría de flujo y microscopia confocal del tejido intestinal, podemos entender cómo inmunoestimulantes o vacunas son capaces de cruzar las barreras de la mucosa intestinales, pasan a través de la lámina propia, y llegar a los músculos, ejerciendo un efecto sobre el sistema inmune de mucosa intestinal. El modelo podría utilizarse para probar la profilaxis oral candidato y sistemas de administración o el efecto local de cualquier compuesto bioactivo administrado por vía oral.
Introducción
El objetivo de este artículo es describir en profundidad un método sencillo para la intubación por vía oral del pez cebra, junto con útiles procedimientos asociados de aguas abajo. Intubación por vía oral utilizando el pez cebra se ha convertido en un modelo práctico en el estudio de la dinámica de enfermedades infecciosas, vacuna oral/inmunoestimulante, absorción de la droga/nanopartículas y eficacia e inmunidad mucosa intestinal. Por ejemplo, pez cebra intubación por vía oral se ha utilizado en el estudio del marinum de la micobacteria y Mycobacterium peregrinum infección1. Lovmo et al. también utilizado con éxito este modelo entregar nanopartículas y M. marinum del tracto gastro-intestinal de pez cebra adulto2. Además, Chen et al. usaron intubación oral de pez cebra para mostrar que las drogas encapsulan por nanopartículas, cuando administrados a través del tracto gastro-intestinal, fueron transportados a través de la barrera de cerebro de sangre3. Estos autores realizaron intubación basada en el método de gauvage descrito por Collymore et al. 4 con algunas modificaciones. Sin embargo, no presentó un protocolo muy detallado que describe el procedimiento de intubación por vía oral. Aquí, presentamos un método para la intubación por vía oral de pez cebra adulto partiendo de Collymore et al. 4 además incluimos la preparación del intestino para el pertinente análisis aguas abajo por microscopía confocal, citometría y qPCR.
El intestino y especialmente de su mucosa es la primera línea de defensa contra la infección y el sitio principal de absorción de los nutrientes5. Cuando las células epiteliales y células presentadoras de antígeno en las barreras mucosas perciban señales de peligro, se activa una respuesta inmune innata inmediata. A continuación, la respuesta inmune adaptativa altamente específica se establece por de6,de los linfocitos T y B7. Desarrollo de vacunas orales es una zona de enfoque actual en vacunología. Las vacunas sería una herramienta eficaz para proteger el organismo en lugares expuestos debido a la respuesta específica de las células inmunes de los tejidos linfoide mucosa-asociado (Malta)8,9. En acuicultura, mucosa vacunas tienen ventajas evidentes en comparación con las vacunas inyectables. Prácticas para la vacunación masiva, requiere menos mano de obra, son menos estresantes para los peces y puede ser administradas a los peces jóvenes. Sin embargo, los candidatos de vacuna contra la mucosa deben alcanzar el segundo segmento del intestino sin ser desnaturalizado en el ambiente oral. También debe cruzar las barreras mucosa para acceder al antígeno que presenta las células (APCs) para inducir respuestas locales o sistémicos10. Por lo tanto, la prueba de la absorción mucosa mediante antígenos orales candidato y sus sistemas vectores, así como de la respuesta inmunitaria evocada, es esencial en el desarrollo de vacunas orales.
En un contexto biomédico, desarrollando un modelo para probar los efectos biológicos de compuestos después de intubación por vía oral es de creciente interés. Se conservan muchas de las características anatómicas y fisiológicas del intestino entre los linajes de hojas, con mamíferos y peces óseos11. Este modelo de intubación oral conectado para análisis de aguas abajo puede ser una herramienta para proporcionar penetraciones en la biología humana, así como un campo de pruebas para productos biológicos u otros compuestos en vivo.
El protocolo de intubación por vía oral puede realizarse por un operador, por ejemplo, administrando con éxito hasta 50 μl de la suspensión de nanopartículas de proteína pescado pesa 1 g, con una tasa alta de supervivencia. El procedimiento es fácil de configurar y rápido; 30 peces pueden ser intubados en 1 h. El protocolo para la preparación del intestino es fundamental para proporcionar muestras de células y tejidos de calidad para su posterior análisis. Se dan ejemplos de los resultados posteriores que demuestran la utilidad del protocolo en la obtención de datos relacionados con la absorción intestinal y en el aislamiento de RNA de calidad para qPCR. El protocolo sería de gran utilidad para aquellos que necesitan un modelo conveniente para probar la dinámica de la profilaxis orales u otros compuestos en el intestino.
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales con el pez cebra (Danio rerio) fueron autorizados por el Comité de ética de la Universitat Autònoma de Barcelona (número CEEH 1582) de acuerdo con los principios rectores de la Internacional de la investigación que implica animales ( EU 2010/63). Todos los experimentos con el pez cebra vivo se realizaron en 26 – 28 ° C.
1. preparar el equipo para intubación Oral
- Coloque aproximadamente 1 cm de un tubo fino de silicona en una 31 G Luer lock aguja para cubrir la punta de la aguja.
- Corte una pipeta de filtro estéril 10 μl Punta (unos 2 cm), tome el extremo más fino y colocar sobre el tubo de silicona como una vaina. Asegúrese de que la pipeta se extiende más allá de la punta de la aguja para evitar lesiones al animal.
- Conecte la aguja a una jeringa de 100 μl Luer lock.
Nota: Siempre enjuagar con etanol y luego fosfato tampón salino (PBS, vea materiales) completamente entre los tratamientos.
2. soluciones necesarias
- Preparar 150 mg/L (para la anestesia) o 300 mg/L (para el euthanasia) de solución de Metanosulfonato (MS-222) 3-aminobenzoato de etilo con agua del acuario donde se mantiene el pez cebra. Llenar un tanque pequeño con 1 L de solución anestésica y mantenerla aireada.
- Llenar otro tanque pequeño con 1 L de agua del acuario sin MS-222 para la recuperación de peces y mantenerla aireada.
- Tomar 50 mL de 1 x PBS 10 x solución estéril.
- Para aislamiento de células análisis intestinal de citometría, preparar suficiente fresco colagenasa 0,15% solución tipo IV 1 mL por peces de una solución madre o de polvo en medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 1% v/v penicilina y estreptomicina (ver materiales). Hacer alícuotas (1 por pescado) de 1 mL en tubos de centrífuga de 2 mL. Mantener a 4 ° C hasta 30 minutos antes del paso de la disección.
- Para la fijación de la muestra de microscopía confocal, preparar 50 mL de solución fresca de paraformaldehido (PFA) de 4% en PBS o descongelar una solución stock de congelador de-20 ° C en una campana de humos.
PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Por favor, lea la hoja de datos seguridad del material antes de trabajar con él. Guantes y gafas de seguridad debe llevarse y dejar siempre soluciones dentro de una campana de humos.
3. preparación de la suspensión de nanopartículas fluorescentes
- Etiqueta de la nanopartícula de proteína con éster de NHS Atto-488 (véase Tabla de materiales) o un colorante fluorescente adecuado según las instrucciones del fabricante.
- Resuspender las nanopartículas en 0.1 M tampón de bicarbonato de sodio en concentración de 2 mg/mL.
- Disolver el éster Atto 488 NHS en amina-libre dimetilsulfóxido (DMSO) 2 mg/ml. Mantener una alícuota de 10 μL para comprobar eficiencia etiquetado (paso 3.7-3.8).
- Mezclar las nanopartículas y el éster de Atto 488 NHS en un cociente molar de 1:2 (proteína: tinte) por agitación en la oscuridad.
- Desactivación de las nanopartículas marcadas por centrifugación a 8.000 x g por 10 min a temperatura ambiente, quite el sobrenadante y guardarlo para comprobar eficiencia etiquetado (paso 3.7-3.8).
- Lave las nanopartículas marcadas por resuspender en 1 mL de tampón de bicarbonato de sodio de 0.1 M por Vortex y pipeteo arriba y abajo. Luego desechar el sobrenadante por centrifugación a 8.000 x g por 10 min a temperatura ambiente. Repita el paso 3.6 por 5 veces.
- Resuspender el precipitado en 5 mL de buffer de bicarbonato de sodio de 0.1 M en un tubo de centrífuga de 15 mL y hacer alícuotas de nanopartículas fluorescentes en tubos de centrífuga de 1,5 mL (30 alícuotas). Desactivación a 8.000 x g por 10 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y almacenar a-80 ° C, protegido de la luz.
-
Medir la eficiencia etiquetadora usando un espectrofotómetro microvolume.
- Toma 1 μl de la solución original de Atto 488 guardada en el paso 3.3 y más diluirla en DMSO (p. ej., 1:20 según el cociente del volumen). Este es el volumen que se usa para obtener la fracción molar de la proteína nanopartículas y Atto 488 mix en el paso 3.4.
- Tomar 1 μl del sobrenadante guardado de la reacción de etiquetado en el paso 3.5. Medir la absorción (abs) en = 501 nm. El porcentaje de etiquetado es:
(
- Antes del experimento, preparar la suspensión de nanopartículas en la concentración deseada usando solución de PBS 1 x.
4. pez cebra anestesia e intubación Oral
- Rápido de los peces (> 0,5 g) por lo menos 48 h antes del experimento para vaciar el intestino.
- Mover los peces (12 peces) a los tanques experimentales (6 L) una noche antes del experimento para permitir la aclimatación12.
- Vórtice de la solución de nanopartículas bien (por ejemplo, 2.500 rpm y 30 s) y el volumen de la suspensión de nanopartículas (por ejemplo, 20 a 50 μL) en la jeringa a la aguja protegida.
- Coloque el pescado en el aireado 150 mg/L MS-222 solución (ver sección 2) hasta que se hunda hasta el fondo del tanque y no responden a una pizca de la aleta caudal; Este proceso tarda menos de 5 minutos.
- Rápidamente los peces anestesiados con una red de transferencia a una bandeja de plástico mojada, orientan el animal horizontalmente para enfrentar la aguja y comenzar inmediatamente la intubación por vía oral.
- Cuidadosamente el pescado con una mano de apoyo y abrir la boca con la otra mano, con la aguja protegida. Inserte suavemente la aguja abajo del esófago a aproximadamente 1 cm de abertura de la boca.
Nota: El operador puede sentir una ligera resistencia cuando el extremo de la punta de la pipeta ha pasado el gill. Tenga cuidado de no ángulo de la entrada de la aguja demasiado que puede perforar el gill. - Inyecte lentamente la suspensión de nanopartículas en los peces. Asegúrese de que la suspensión no fluye hacia afuera a través de las branquias o en la boca.
- Suavemente Retire la aguja y coloque el pescado en el tanque de recuperación (véase sección 2). La recuperación toma generalmente dentro de 1 minuto.
- Compruebe el pescado cuidadosamente para cualquier anomalía (p. ej., hemorragias en las agallas es un signo de perforación).
- Una vez que los peces se han recuperado, devuelven a los tanques experimentales.
5. pez cebra intestino disección
- Después de un período especificado de tiempo post intubación (p. ej., 5 h o 24 h), coloque el pescado con una red en MS de 300 mg/L-222 solución para eutanasia (ver sección 2). Asegúrese de que el opérculo se detiene y no hay ningún reflejo de pizca de cola. Cinco minutos es normalmente suficiente.
- Recoger la eutanasia animal con una red y colocarlo en un filtro de papel.
Nota: El papel de filtro es muy útil para eliminar el tejido adhesivo a lo largo del intestino. - Usando las tijeras de disección cortante, realizar una incisión semicircular por el ano al opérculo y abierta la incisión con unas pinzas finas. Cortar ambos extremos del intestino, sacar todos los órganos internos y en el papel de filtro.
PRECAUCIÓN: Trabajar rápidamente para reducir la muerte y el metabolismo de la célula.
Nota: Como alternativa, retire el tejido adhesivo en PBS y en el hielo. - Separar el intestino de órganos internos, asegurándose de mantener su orientación (anterior posterior del segmento intestinal) y se extienden hacia fuera. Generalmente, es más ancho que el segmento posterior del segmento anterior del intestino. Tenga cuidado para obtener todo el intestino cuando la disección.
Nota: El extremo posterior es muy fina y frágil en pequeños peces y puede romperse, particularmente en los animales < 0.7 g. - Rollo el intestino en el papel de filtro con unas pinzas para separar el tejido adhesivo del intestino.
- Proceder a preparar el intestino para distintos análisis aguas abajo (secciones 6, 7 y 8).
6. preparación de las células intestinales por citometría de
- Prepara con antelación alícuotas de solución de colagenasa de 0.15% (ver sección 2.4).
Nota: Alícuotas deben estar a temperatura ambiente antes de proceder. - Opcional: Continuando con paso 5.5, la raja abierta del intestino longitudinalmente y lavar con PBS 1 x.
- Utilizando pinzas, coloque el intestino en el tubo de centrífuga de 2 mL con solución de colagenasa de 0.15%.
- Colocar los tubos en un agitador de laboratorio vertical por 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Colocar el intestino en un colador de celda de 100 μm apoyado sobre un tubo de centrífuga de 50 mL. Romper el intestino con un émbolo de la jeringa de 5 mL, lavar 3 veces con PBS 1 x, que recoge el flujo a través de la muestra en el tubo de centrífuga de 50 mL.
- Centrifugar el tubo de centrífuga de 50 mL a 400 x g durante 10 min, 4 ° c.
- Cuidadosamente pipetee la mayoría del sobrenadante al mismo tiempo no perder las células, algunas de las cuales pueden estar asociados a la mucosa.
- Resuspender las células intestinales en la parte inferior del tubo de centrífuga con 500 μl de PBS 1 x y mantener en hielo hasta análisis de citometría
- Muestras de filtro mediante 30 μm filtro células en 5 mL alrededor de tubos para citometría.
- Establecer los parámetros (por ejemplo, el número de células para el análisis, la región de interés, tensión y compensación, selección de detectores) en un equipo de citómetro (ver materiales).
- Inmediatamente analizar las células en un citómetro, siguiendo las instrucciones de uso13.
7. preparación del intestino Cryosections para Microscopía Confocal
- Llenar el molde de plástico (véase Tabla de materiales) a mitad de volumen con la temperatura de corte óptimo (O.C.T.) compuesto.
- Continuando desde el paso 5.5 e inmediatamente después de la disección, coloque con cuidado el intestino en el molde de plástico. Asegúrese de que el intestino está totalmente embebido en el compuesto O.C.T.. Si es necesario, añadir más O.C.T. compuesto en el molde de plástico.
Nota: Se recomienda colocar el intestino en forma de "Z" en O.C.T. compuesto seguir fácilmente su orientación natural. - Coloque el molde de plástico en hielo seco hasta que se opaca (menos de un minuto).
- Guarde el molde de plástico a-80 ° C para uso a largo plazo o proceso inmediatamente con el siguiente procedimiento.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Cortar el intestino congelado en 10 μm secciones o espesor adecuado con un criostato a-20 ° C.
- Recoge la sección del intestino con un pincel fino sobre una diapositiva.
- Sumerja el portaobjetos en el 4% PFA durante 15 min a temperatura ambiente para fijar la muestra.
PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Por favor, lea la hoja de datos seguridad del material antes de trabajar con él. Guantes y gafas de seguridad debe llevarse y dejar siempre soluciones dentro de una campana de humos. - Lavar lo portaobjetos 3 veces con PBS de x 1, 10 minutos cada uno.
- Añada una gota de medio de montaje y colocar un cubreobjetos sobre la muestra.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Observar la muestra bajo un microscopio confocal con un aumento adecuado.
8. preparar el intestino para qPCR de tiempo Real (RT-qPCR)
- Continuando desde el paso 5.5, colocar el intestino en un frasco de criogénico y congelar rápidamente el intestino en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C hasta su uso.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - De homogeneización, añadir 200 μL de 2% (v/v) enfriar 1-Thioglycerol/homogeneización solución (véase Tabla de materiales) o solución alternativa homogeneización de la muestra del intestino.
- Trabajar con rapidez, homogeneizar la muestra del intestino en el hielo con un homogeneizador de laboratorio de alta velocidad (ajuste a 25-30.000 rpm) hasta no tejido visible fragmentos permanecen. 3 veces durante 5 s es generalmente suficiente.
- Aislar RNA usando un comercial kit (véase Tabla de materiales) según las instrucciones14 el fabricante o un método alternativo adecuado. Es necesario, guardar el ARN a-80 ° C para uso a largo plazo.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Cuantificar la concentración de RNA utilizando un espectrofotómetro15 y evaluar la calidad, utilizando un analizador de RNA16.
- Preparar 1 μg o una cantidad apropiada de cDNA usando un cDNA síntesis kit según las instrucciones del fabricante.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Para el análisis de qPCR, siga las directrices MIQE del17. - Diseño de pares de imprimación adecuada para gene/s de interés.
- Seleccione un gen de referencia adecuados y analizar la expresión de cada gen por una detección RT-qPCR sistema usando un comercial kit (ver materiales).
Nota: por ejemplo, añadir 5 μl de supermix verde de SYBR, 0,5 cartillas μm, 2.5 μl de cDNA diluido y 1,5 μl de agua en un volumen final de 10 μl de cada pocillo de la placa de la qPCR.
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Resultados
Pez cebra (peso promedio: 1.03 ± 0.16 g) del sexo mezclado con éxito fueron intubados con nanopartículas de diferentes proteínas recombinantes (cuerpos de inclusión bacterianas) usando nuestro dispositivo de intubación oral hecho en casa (figura 1). Con éxito hemos realizado la intubación oral y logra un bajo porcentaje promedio de mortalidad (6,8%) (Tabla 1). Pez cebra fueron bien intubado con 30 μL o 50 μl de las suspensiones de nanopartícu...
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Discusión
Este protocolo es una mejora de la técnica descrita para la intubación por vía oral por Collymore et al. 4 nuestro protocolo describe detalladamente el método de intubación por vía oral e incluye la preparación del intestino para análisis posteriores. Nuestro método mejora la velocidad de manipulación de pescado permitiendo a una persona realizar el protocolo completo rápidamente, sin mucha variación entre operadores. Una principal diferencia de nuestro protocolo con la anterior es que ev...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos existen.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por becas del Ministerio de ciencia, Comisión Europea y los fondos AGAUR para NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER y AGAUR 2014SGR-345). RT tiene una beca predoctoral AGAUR (España), JJ fue apoyada por una beca de doctorado del Consejo de becas de China (China) y NR es apoyado por el programa de Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Agradecemos el asesoramiento experto en la producción de proteína, N. Barba desde el "Servei de Microscopia" Dr. Torrealba y Dr. M. Costa del "Servei de Citometria" de la Universitat Autònoma de Barcelona asistencia técnica útil.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de silicona | Dow Corning | 508-001 | 0,30 mm de diámetro interior y 0,64 mm de diámetro exterior |
| Aguja Luer lock | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Jeringa Luer lock | Hamilton | 81020/01 | 100 μ L, Kel-F Hub |
| Punta de pipeta filtrada | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μ L |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | polvo |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Papel de filtro | Filtro-Lab | RM14034252 | |
| Colagenasa | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's Dulbecco's |
| Medium Penicilina y estreptomicina | Gibco | 15240 | |
| Colador de células | Falcon | 352360 | |
| Filtros CellTrics | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 y micro; Filtros de tamaño de malla m con depósito de 2 mL |
| Compuesto Tissue-Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | |
| Moldes de plástico para criosecciones | SAKURA | 4557 | Moldes de vinilo desechables. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Diapositiva | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus |
| Portaobjetos | Labbox | COVN-024-200 | 24&agudo; 24 mm |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS éster | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyKit de tejido de ARN | Promega | AS1340 | |
| 1-Tioglicerol/Homogeneización solución | Promega | Dentro de Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit añadiendo | 20 μ l 1-tioglicerol a 1 mL de solución de homogeneización (2%) |
| rotador de laboratorio vertical | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Homogeneizador | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Citómetro de flujo | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL tubo de fondo redondo | Falcon | 352058 | |
| Microscopio confocal | Leica | SP5 | |
| Campana extractora | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Espectrofotómetro |
| Agilent 2100 Sistema Bioanalizador | Agilent | G2939A | Bioanalizador de ARN |
| Instrumento Maxwell | Promega | AS4500 | |
| Kit de síntesis de ADNc iScript | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 PCR en tiempo real Sistema | de detección Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Agua | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Vial criogénico | Thermo Fisher Scientific | 375418 | vial CryoTube |
| Medio | de montaje Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield con DAPI |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
