Aquí, presentamos un protocolo para detectar la presencia de neutrófilos en las secciones fijas/permeabilized histología y evaluar el estado de activación de los neutrófilos purificados vivo. En particular, el péptido de40 MUB ATA lactoferrina presente en gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. Exposición de los contenidos del gránulo a través de permeabilización o neutrófila activación permite el marcado de los neutrófilos.
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El péptido de40 de MUB para uso en la detección de eventos de la inflamación mediada por neutrófilos
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Resumen
Resumen
Presentamos un protocolo que implica el uso de MUB40, un péptido sintetizado con la capacidad de enlazar glucosilada lactoferrina almacenado en altas concentraciones en específicos y terciarios los gránulos de los neutrófilos. Este detalles del protocolo MUB40 conjugado directamente a un fluoróforo pueden utilizarse para teñir neutrófilos en tejidos fijados/permeabilized así como cómo esto puede ser usado en imágenes de células vivas al ensayo para la granulación y la activación de neutrófila. Métodos de detección de neutrófilos se limitan a anticuerpos monoclonales específicos para cada especie, que no siempre son convenientes para ciertas aplicaciones. MUB40 no penetra la membrana celular y por lo tanto se excluye de lactoferrina en neutrófilos no-activado/no-permeabilized. MUB40 tiene la ventaja de reconocer lactoferrina de un rango de hospederos amplio, lo que es especialmente útil para comparar resultados en estudios con múltiples modelos de investigación, reduciendo el número de duplicados y simplificando protocolos a través del solo paso de tinción.
Introducción
Neutrófilos son uno de los principales brazos del sistema inmune innato y son reclutados sistemáticamente a los sitios de inflamación alrededor del cuerpo. El estudio de los neutrófilos se ha deteriorado en gran parte por su corta vida útil en vitro (menos de 8 h) y herramientas de detección limitada bajo condiciones basales o luego de la activación. Aquí, presentamos un protocolo bien probado para la detección amplio y específico de los neutrófilos mamíferos en muestras fijas/permeabilized. También proporcionamos un protocolo detallado para la tinción energizados neutrófilos con MUB40. Utilizando el protocolo de tinción neutrófilo vivo, el momento y el lugar de la activación de neutrófila pueden ser identificados. Este protocolo es ideal para investigadores que deseen estudiar la liberación de activación o del gránulo neutrófilo. Más allá de sus funciones antimicrobianas, neutrófilos ahora son apreciados como inmunomoduladores de células implicadas en una amplia gama de enfermedades y la respuesta inmune (innata y adaptativa)1,2. Están presentes en los tejidos más inflamatorios, en un número elevado en los tejidos infectados, en tumores inflamatorios3, IBS y enfermedad de Crohn las llamas4y en áreas de inflamación no infecciosa como el synovia de la artritis reumatoide (neutrófilos Pacientes de RA)5. Neutrófilos contienen cuatro clases de gránulos preformados llamados azurófilos (α), específicos (β1), gránulos terciarios (β2) y vesículas secretoras (γ)6. Migración a un sitio inflamatoria, neutrófilos reclutados se activan y secuencialmente secretan gránulos contenidos (compuestos de adherencia, compuestos antimicrobianos y moléculas inmunomoduladoras), que promueve la contratación y contribuye a resolución (pero también al daño de tejido de host) de infección7. Neutrófilos se consideran un aspecto fundamental de la inmunidad innata, hasta la fecha hay son pocos reactivos de detección disponibles para estudiarlos, y aun menos que puede utilizarse para evaluar el estado de activación de los neutrófilos de vida.
Los métodos actuales de detección de neutrófilos dependen de anticuerpos monoclonales generados contra los antígenos expuestos superficie de la célula, como proteínas específicamente almacenadas en gránulos neutrófilos bajo condiciones basales (por ejemplo, mieloperoxidasa o Ly - 6 G2 lactoferrina). Ventajas de anticuerpos monoclonales incluyen su atascamiento fuerte sensibilidad y versatilidad en diferentes condiciones de ensayo. Sin embargo, hay varias desventajas al uso de anticuerpos monoclonales y anti-Ly - 6G en particular. Estas desventajas incluyen la especificidad, como Ly - 6G está presente en la mayoría de las células mieloides en médula ósea y sobre todo granulocitos incluyendo eosinófilos; por lo tanto, descifrar neutrófilos de eosinófilos con este marcador requiere complejos más se acerca a8. Otro intercambio frecuente con anticuerpos monoclonales es su anfitrión a menudo limitada especificidad, dificultando los estudios de comparación con más de una especie animal. Un tercer inconveniente de los métodos de detección de anticuerpos, especialmente cuando se utilizan células vivas o en vivo, es su potencial para alterar la función de la célula o llevar a la activación de la célula. Por ejemplo, la administración de anti-Ly - 6G a los ratones se aplica comúnmente a agotamiento del neutrófilo y neutropenia transitoria9. Además se ha demostrado que la inyección de anticuerpos puede estimular función antitumoral neutrófilos10. Finalmente, la detección de anticuerpo de neutrófilos no revela el estado de activación de la célula.
Hemos identificado un péptido de 40 aminoácidos llamado MUB40, que puede utilizarse en un número de ensayos para etiqueta de neutrófilos bajo condiciones en vitro o en vivo , así como analizar el estado de activación de neutrófilos en11. MUB40 se deriva de MUB7012, un dominio de la proteína de unión a moco superficial Lactobacillus reuteri , descrito originalmente por su capacidad para enlazar moco13,14. MUB40 interactúa con lactoferrina glucosilada que está presente en altas concentraciones en los gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. MUB40 puede estar expuesto a estos gránulos a través de pasos de permeabilización estándar presentes en la histopatología o celular activado por fluorescencia clasificación protocolos (FACS) para tinción robusto de neutrófilos fijadas. Cuando neutrófilos vivo se mantienen en un estado inactivo, el péptido de40 MUB queda excluido de los contenidos del gránulo, y células no tiñen positivamente con el marcador. Después de la activación, MUB40 puede enlazar a la lactoferrina expuesta y conducir a coloración robusta con el péptido. Por ello, MUB40 puede utilizarse para determinar el estado de activación de los neutrófilos purificados, lo que es un marcador de atractivo a seguir el proceso infeccioso. La capacidad de enlazar a vivir neutrófilos activados también permite MUB40 para ser utilizado como una herramienta para detectar áreas de inflamación neutrófila en modelo animal vivo (por ejemplo, un ratón artritis modelo15). Los protocolos en este detalle del manuscrito como fluorescencia etiquetada MUB40 pueden utilizarse para revelar neutrófilos en histología tejidos y cómo analizar la activación de neutrófilos purificados vivo en vitro.
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido revisados y aprobadas por las organizaciones francesas CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) y CNIL (Comisión Nationale Informatique et Liberté).
1. neutrófilos en la histopatología del tejido con la coloración fluorescente etiquetado MUB40
- Para obtener el tejido para histopatología, fijar las secciones de biopsia de tejido en un volumen adecuado de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 minutos hasta 4 h dependiendo del grosor de la muestra. Coloque las muestras en un refrigerador de 4 ° C durante la fijación.
Nota: Métodos/tiempos de fijación alternativos pueden ser sustituidos en base a las necesidades del usuario único.- Quitar la PFA 16% solución de sucrosa con suficiente volumen para cubrir completamente la muestra y coloque la muestra a 4 ° C por 4 h hasta la noche.
- Retirar 16% sacarosa solución Agregar solución de sacarosa al 30% en un volumen lo suficientemente grande como para cubrir completamente la muestra y colocar a 4 ° C por 4 h hasta la noche.
- Retirar la solución de sacarosa de 30% y luego el exceso de tejido con una toalla de papel. La sección del tejido en medios de comunicación de corte óptima temperatura (OCT) y snap-congelación de 2-Metilbutano enfriado en un baño de hielo seco-etanol (-72 ° C). Una vez congelado sólido (después de 2 min), retire los bloques de 2-Metilbutano y en hielo seco hasta que todos los bloques están terminado y listo para almacenamiento a largo plazo. Almacenar los bloques congelados a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
- La noche antes de ser corte, retire del congelador de-80 ° C y colocarlos a-20 ° C durante la noche para equilibrar bloques de tejido.
- Con un criostato, cortar tejido encajado OCT 10 - 30 μm de espesor y absorber a las diapositivas de vidrio de alta calidad.
Nota: Pueden utilizarse rodajas más gruesas o más finas según los requerimientos experimentales. - Con un lápiz de cera u otro método hidrofóbico, dibujar un cuadro alrededor de la rodaja de tejido sobre el portaobjetos de vidrio y dejar secar.
- Prepare la solución de tinción mediante la realización de una dilución de 1:1,000 de MUB40-Cy5 (u otra versión fluorescente de40MUB, solución stock de 1 mg/mL) en solución al 0.1% saponina-PBS. La óptima concentración de40 de MUB final debe ser 1 μg/mL.
Nota: Se pueden utilizar concentraciones finales inferiores (0.1-0.01 μg/mL) pero puede llevar a bajar la intensidad de la señal.
PRECAUCIÓN: Polvo de saponina puede causar irritación respiratoria. Asegúrese de que a pesar de la saponina en un gabinete o protegidas. Pueden utilizarse métodos de permeabilización alternativos tales como Triton. Agregar marcadores adicionales en concentraciones recomendadas por el fabricante (e.g., 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, anticuerpos fluorescentes). - Sumergir suavemente el portaobjetos de cristal en una solución de saponina-PBS 0.1% tres veces.
- Cuidadosamente, Seque lejos exceso de líquido alrededor de la sección de tejido y añadir suficiente solución de tinción para cubrir completamente la sección del tejido. Colocar el portaobjetos en una cámara de humedad para evitar la evaporación e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Mantenerlo protegido de la luz.
- Sumergir suavemente el portaobjetos en solución de saponina-PBS 0.1% 3 x. Luego, suavemente sumergir el portaobjetos en solución de PBS 3 x. Finalmente, suavemente sumergir el portaobjetos en agua destilada H2O x 3. Cuidadosamente seque el exceso de líquido de la diapositiva.
- Agregue una pequeña cantidad (20 μL) de medio de montaje (20 mM Tris, pH 8.0, 0.5% N-propil galato, 90% glicerol) al lado de la rebanada de tejido y colocar suavemente un cubreobjetos de cristal sobre el portaobjetos de cristal. Uniformemente y suavemente presione el cubreobjetos sobre la sección del tejido y, usando una toalla de papel, retire con cuidado cualquier medio de montaje que saca alrededor de los bordes del cubreobjetos.
- Coloque el portaobjetos montado en un gabinete oscuro durante 24 horas permitir que los medios de montaje solidificar. Como alternativa, coloque el portaobjetos montado a 37 ° C durante 1 hora.
- Con un criostato, cortar tejido encajado OCT 10 - 30 μm de espesor y absorber a las diapositivas de vidrio de alta calidad.
- Imagen de las rebanadas de tejido en un microscopio de fluorescencia según el método de adquisición deseada.
2. visualización de la activación de neutrófila con Retro-Inverso-MUB40-Cy5 péptido
- Obtener los neutrófilos humanos con el siguiente protocolo. Preparar las siguientes soluciones y colocarlas en una gabinete anoxia durante la noche. Exposición al oxígeno empezará a activar neutrófilos e inducir aún más la célula muerte16,17.
Nota: Neutrófilos pueden ser alternativamente purificados "en el Banco" para MUB40-etiquetado experimentos; sin embargo, tenga en cuenta que la exposición al oxígeno comenzará a afectar Activación Neutrófila.- Prepare la siguiente solución:
Solución 1 [cloruro de sodio (NaCl) 0,9%]: Añadir 4,5 g de NaCl en 500 mL de H2O. filtro la solución.
Solución 2 (6% de dextrano): agregar 6 g de dextrán en solución de NaCl al 0.9% a 100 mL.
Solución 3 (tampón de lavado): disolver el ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en pH 7.2 del PBS a una concentración final de EDTA de 2 milímetros. Inmediatamente antes del uso, disolver albúmina de suero bovino (BSA) en solución de PBS/EDTA tal que la concentración final de BSA es 10% p/v. - Centrifugar sangre colección tubos a 650 x g por 20 min sin interrupciones.
- Sin interrumpir la sangre separado, transferir los tubos para recogida de sangre a una fracciones anóxica gabinete y recoge el plasma (parte superior) en un tubo cónico de 50 mL.
- Quitar el tubo que contiene el plasma del gabinete anóxico y centrifugar a 2.900 x g por 20 min con descansos para que sedimenten las plaquetas.
- Sin interrumpir las plaquetas concentradas, transferir suavemente el tubo de plasma hacia el gabinete anóxico y la pipeta el plasma pobre en plaquetas en un nuevo tubo 50 mL (en lo sucesivo llamado "plasma").
- Prepare la siguiente solución:
- Separación de los glóbulos rojos de los leucocitos
- Utilizando los tubos que contienen los glóbulos rojos (gr) en el paso 2.1.3., los hematíes se combinan en un tubo cónico de 50 mL (5 sangre colección tubos contenidos por el tubo de 50 mL).
- Añadir NaCl 0.9% hasta que el volumen total alcanza los 44 mL. Añadir 6 mL de dextrano 6% (último).
- Mezclar la mezcla de sangre/dextran suavemente invirtiendo el tubo 10 - 20 veces. Que el sedimento del tubo por lo menos 30 minutos.
- Mientras se produce la sedimentación, preparar un gradiente de Percoll agregando 4,2 mL de Percoll solución a 5,8 mL de plasma en un tubo cónico de 15 mL y mezclar bien por inversión del tubo.
- Recoger la fracción superior de la dextrano intentando evitar pipetas de glóbulos rojos.
- Apretar el tapón, quitar el tubo del dextrano de la cámara anóxica y centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 min con descansos.
- Con cuidado coloque el tubo en la cámara anóxica sin molestar a las celdas de peletizado y extraer el líquido a través de pipeteo.
- Suavemente, vuelva a suspender el precipitado de células en 1 mL de plasma y agregue muy lentamente a la parte superior de la solución de Percoll. Tenga cuidado de no inducir la mezcla de las capas al pipetear las células en la parte superior.
- Retire con cuidado el tubo de solución de Percoll de cámara anóxica (evitando la mezcla) y centrifugar a 800 x g por 20 min sin interrupciones. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) permanecerá en la superficie de la solución de Percoll y neutrófilos a pellet con los hematíes.
- Eliminación de contaminación de los glóbulos rojos
- Preparar 14 mL de solución tampón de lavado al agregar 700 μL PBS + BSA de 10% a 14 mL de tampón de lavado.
- Coloque el tubo de solución de Percoll en la cámara anóxica. Retire el Percoll y PBMCs mediante pipeteo y resuspender las células concentradas en 1 mL de solución tampón de lavado. El sedimento se suspende de nuevo tendrá un color rojo debido a los glóbulos rojos contaminantes.
- Añadir 200 μL de bolas magnéticas anti-CD235a (glycophorin) a las células suspendidas de nuevo, mezclar suavemente e incubar durante un mínimo de 15 minutos. Este paso carga los hematíes contaminantes con bolas magnéticas que se pueden quitar.
- Tampón de lavado la columna de la separación con 2 mL de lavado 3 x.
- Sosteniendo un tubo cónico de 15 mL en la columna de separación, pipeta lentamente la mezcla de neutrófilos, GR en la parte superior de la columna. Fluyen a través de recoger las células en el tubo cónico de 15 mL. El paso debe ser nublado y pierden su color rojo debido a los hematíes queda enlazado a la columna.
- Añadir 2 mL de tampón a la parte superior de la columna de lavado y recoger en el mismo tubo cónico de 15 mL. Al final de la colada de 2 mL, el flujo a través deben ser claro, lo que significa que los neutrófilos han sido recogidos.
- Mezclar suavemente el tubo para asegurar incluso la distribución de los neutrófilos y recoger 10 μL para el recuento celular. Tenga en cuenta el volumen final de celda contando fines. Enumerar el número total de células con cualquier celular estándar método de conteo.
- Retire el tubo del neutrófilo de la cámara anóxica y centrifugar a 300 x g durante 20 min con descansos a los neutrófilos.
- Coloque neutrófilos sedimentados en la cámara anóxica y quitar el tampón de lavado mediante pipeteo. Resuspenda el sedimento neutrófilo en plasma con una densidad celular máxima de 107 PMN/mL.
- Recuento de neutrófilos purificados y visualización utilizando MUB40
- Añadir 1 μL de RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) a 1 mL de medio de Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sin rojo de fenol. Mezclar mediante pipeteo bien.
- Para los efectos del presente Protocolo, el resultado ha sido delineado como si un potente neutrófilo activación reactivo, N-formilmetionil-leucina-fenilalanina (FMLP), se añade. Añadir 1 μm de FMLP RPMI/RI-MUB40-Cy5 tubo y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
Nota: Cada procedimiento experimental será diferente de aquí en adelante, dependiendo de las preguntas que se están abordadas. - Transfiera el 1 mL RPMI/RI-MUB40-Cy5/FMLP mezcla a un plato de microscopia de fondo de cristal. A este plato, agregar un volumen de células purificadas correspondientes a 106 total neutrófilos. Mezclar mediante pipeteo suave.
- Coloque el plato en un microscopio fluorescente invertido y comenzar la adquisición de la imagen. Por ejemplo, se recomienda adquirir imágenes de línea de base antes de la adición de un reactivo activador de neutrófilo FMLP como bacterias. En este ejemplo, iniciar la adquisición de RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrófilos y en un punto posterior, pipetear el reactivo activador de neutrófilo en el plato de vidrio y continuar la adquisición de la imagen.
Nota: Modificaciones en estos pasos pueden hacer basados en las necesidades científicas. - Proceso adquirido películas imágenes/time-lapse como pertenece al microscopio específico utilizado.
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Resultados
Resultados de MUB40-tejidos manchados de diapositivas de la histopatología normalmente revelan células individuales dispersadas por todo el tejido. MUB40 manchas de lactoferrina, que está presente en los gránulos neutrófilos y compartimentado. Así, típicamente visto manchas punteadas o varias grandes áreas separadas de la señal viene de los neutrófilos (figura 1). Es útil añadir un segundo marcador de célula como DAPI para ayudar a local...
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Discusión
Aquí, se describen dos ensayos en que el péptido de40 MUB se utiliza para estudiar la activación e inflamación neutrófila. Mostramos cómo puede revelar MUB40 neutrófilos presentan en las secciones de la histopatología o mostrar su estado de activación utilizando neutrófilos purificados vivo. Los pasos críticos para el uso de MUB40 como un reactivo de tinción son los mismos que con cualquier otro método de detección fluorescente. Debe tenerse cuidado para garantizar la compatibilidad de se...
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Divulgaciones
B.S.M. figura como inventor en MUB40 patentes:
MUB40: EP11290403.2 patente Europea, 09/09/2011.
RI-MUB40: EP patente Europea Nº 17306746.3, 12/11/17.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) y convocatoria de ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Péptido fluorescente MUB40 (disponible con otros fluoróforos conjugados) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Péptido MUB40 fluorescente retroinverso. Sintetizado con D-aminoácidos y resistente a las proteasas (disponible con otros fluoróforos conjugados) |
| Parformaldehído | Sigma-Aldrich | 16005 | Fijador para histología |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S7903 | Solución utilizada para eliminar el exceso de PFA |
| Temperatura óptima de corte Compuesto (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Se utiliza para congelar tejido antes del |
| 2-metilbutano | Sigma-Aldrich | M32631 | Se utiliza para congelar tejido antes del corte con criostato |
| Etanol Sigma-Aldrich | 1.00974 | Se utiliza para baño de hielo seco para congelar tejidos | |
| Criostato Leica | Leica Biosystems | CM1520 | Se utiliza para seccionar tejidos |
| Portaobjetos de microscopía de vidrio | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cubreobjetos | Thor Labs | CG15CH | Pluma |
| Sigma-Aldrich | Z377821 | Se utiliza para prevenir la pérdida de líquido durante la tinción de tejidos | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | Se utiliza para permeabilizar células para la tinción de FI |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Tinciones de ADN |
| Alexa fluor 488 Faloidina | Fisher Scientific | A12379 | Se une a la actina |
| Prolong, Gold antidecoloración Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolonga la señal de FI y la resistencia al fotoblanqueo |
| Microscopio fluorescente | Varios | Varios | Se utiliza para obtener imágenes de portaobjetos de FI |
| Gabinete anóxico | Varios | Varios | Se utiliza para la purificación de neutrófilos vivos inactivados |
| Cloruro de sodio NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Componente tampón de lavado |
| MACS BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Componente tampón de lavado |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradiente para purificación de neutrófilos |
| CD235a microperlas magnéticas de glicoforina | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Se utiliza para eliminar los glóbulos rojos contaminantes |
| Columnas LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Se utiliza en la eliminación de glóbulos rojos de neutrófilos |
| RPMI-1640 sin rojo de fenol | Sigma-Aldrich | R8755 | Se utiliza para ensayos de neutrófilos |
Referencias
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