Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores

Summary

Aquí, se presenta un protocolo para el análisis de mediano a alto rendimiento eventos de fosforilación de proteínas a nivel celular. Citometría de flujo de fosfo es un enfoque potente para caracterizar las aberraciones señalización, identificar y validar biomarcadores y Evaluación farmacodinámica.

Abstract

Señalización celular aberrante desempeña un papel central en el desarrollo del cáncer y la progresión. Terapias dirigidas más nuevas son de hecho dirigidas a proteínas y funciones de la proteína, y aberraciones señalización celular por lo tanto pueden servir como biomarcadores para indicar las opciones de tratamiento personalizado. En contraposición a los análisis de ADN y ARN, cambios en la actividad de la proteína pueden evaluar más eficazmente los mecanismos subyacentes de resistencia y sensibilidad de la droga. Phospho citometría de flujo es una técnica poderosa que mide eventos de fosforilación de proteínas a nivel celular, una característica importante que distingue a este método de otros enfoques basados en anticuerpos. El método permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas de señalización. En combinación con códigos de barra fluorescente de la célula, más grande de los conjuntos de datos de mediano a alto rendimiento pueden ser adquiridos por el citómetro estándar hardware en poco tiempo. Citometría de flujo fosfo tiene aplicaciones en estudios de biología básica y en investigación clínica, incluyendo análisis, descubrimiento de biomarcadores y la evaluación de la farmacodinámica de la señalización. Aquí, se proporciona un protocolo experimental detallado para fosfo análisis de flujo de células mononucleares de sangre periférica purificada, usando las células de la leucemia linfocítica crónica por ejemplo.

Introduction

Phospho citometría de flujo se utiliza para analizar los niveles de fosforilación de la proteína unicelular resolución. El objetivo del método es asignar patrones de señalización celulares bajo condiciones especificadas. Aprovechando la capacidad multiparamétrico de citometría de flujo, varias vías de señalización se pueden analizar simultáneamente en diferentes subconjuntos de una población celular heterogénea como la sangre periférica. Estas características ofrecen ventajas sobre otras tecnologías basadas en anticuerpos como inmunohistoquímica, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), matriz de proteína y fase inversa proteína matriz (RPPA)¹. Citometría de flujo fosfo puede combinarse con célula fluorescente código de barras (FCB), que significa que las muestras individuales de la célula están marcadas con firmas únicas de tintes fluorescentes para que pueden ser mezclados, teñidos y analizados como una sola muestra de². Esto reduce el consumo de anticuerpo aumenta la robustez de los datos a través de la combinación de control y las muestras tratadas y mejora la velocidad de adquisición. La población combinada de FCB puede divide en muestras más pequeñas y manchada con hasta 35 anticuerpos fosfo-específicos distintos, dependiendo de la cantidad de material de partida. Grandes experimentos de generación de perfiles, pueden, ejecutar con hardware estándar citómetro. Phospho citometría de flujo se ha aplicado al perfil señalización vías en muestras de pacientes de varios cánceres hematológicos incluyendo leucemia linfocítica crónica (CLL)^3,4,5, leucemia mieloide aguda (AML) ⁶ y non-Hodgkin ' linfomas⁷. Citometría de flujo fosfo es un enfoque potente para caracterizar las aberraciones señalización, identificar y validar biomarcadores y Evaluación farmacodinámica.

Aquí, el protocolo optimizado para el análisis de muestras de pacientes de CLL por citometría de flujo fosfo se proporciona (figura 1A). Se muestran ejemplos de caracterización señalización básica, estimulación de receptor de la célula de anti-IgM/B y perturbación de la droga. Se proporciona una descripción detallada de una matriz de FCB. El protocolo fácilmente adaptables a otros tipos de células de suspensión.

Protocol

Muestras de sangre fueron recibidas tras consentimiento informado por escrito de todos los donantes. El estudio fue aprobado por el Comité Regional de médicos y de salud investigación ética de suroriental Noruega y se llevó a cabo la investigación sobre la sangre humana con arreglo a la declaración de Helsinki⁸.

Nota: Pasos 1-3 deben realizarse bajo condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos.

1. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de muestras de sangre de pacientes de CLL

PRECAUCIÓN: Sangre humana debe ser manejada según normas de bioseguridad nivel 2.

1. Diluir la sangre 1:1 con solución salina con tampón fosfato (PBS: 136,9 mM NaCl, KCl, de 2.7 mM 10,1 mM Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7.4) y transferir a tubos de 50 mL (30 mL/tubo).
2. Capa con cuidado 10 mL de un medio de gradiente densidad (e.g., Lymphoprep) en la parte inferior del tubo con una pipeta de 10 mL.
3. Centrifugar a 800 x g por 20 min a 4 ° C. Las PBMCs ahora son visibles encima de la capa media gradiente de densidad.
4. Utilice una pipeta Pasteur transferir las células a dos nuevos tubos de 50 mL. Lavar dos veces con PBS (llenar los tubos).
5. Centrifugue a 350 x g por 15 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender en 3 mL de PBS.
6. Contar las células usando un método preferido.
7. Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min., descartar el sobrenadante. Nota: Pasos de 1.8 a 3.2 son opcionales. Es posible proceder directamente al paso 3.3.
8. Resuspender las células en suero bovino fetal (FBS) suplementado con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y congelar abajo en alícuotas adecuadas utilizando crio tubos.
   Nota: DMSO es tóxico para las células. Trabajo rápido una vez que las células se mezclan con FBS/DMSO. Las células pueden ser almacenadas a largo plazo en nitrógeno líquido.

2. descongelación de las células

1. Rápidamente descongelar las células en un baño de agua de 37 ° C.
   Nota: DMSO es tóxico para las células. Trabajar rápidamente para limitar la exposición a DMSO.
2. Lavar las células una vez con 10 mL de medio frío del Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640 con GlutaMAX suplementario, véase Tabla de materiales).
3. Centrifugar a 300 x g durante 5 min descartar el sobrenadante.
4. Resuspender las células en RPMI 1640 suplementado con piruvato de sodio, MEM no esenciales aminoácidos y penicilina/estreptomicina (agregado en dilución de 1 x según las instrucciones) y 10% FBS. Transferir las células a un matraz de cultivo de células pequeñas y dejar en un incubador al 5% CO₂, 37 ° C durante 1 hora para permitir a las células calibrar.

3. preparación de las células

1. Contar las células viables usando un método preferido.
2. Transferir las células a un tubo de 50 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 min descarte el sobrenadante.
3. Resuspender las células en Medio RPMI 1640 (paso 2.2) suplidas con 1% FBS a no más de 50 x 10⁶ células/mL.
4. Transferir la cantidad necesaria de la suspensión celular a pozos de una placa de V-inferior bien 96.
   Nota: Número de pozos se corresponde con el número de condiciones para ser probado. Se toman muestras para un curso de tiempo de estimulación de un solo pozo. Calcular la muestra de 50 μL por punto de tiempo + 50 μl de volumen muerto. Guardar las muestras para los controles de compensación (una muestra sin manchas + una muestra por tinte de código de barras).
5. Transferencia del 96 bien la placa a un baño de agua precalentada 37 ° C. Resto de las células durante 10 minutos.

4. estimulación y fijación de las células

Nota: Realice los pasos 4-8 en el Banco de laboratorio (es decir, no estéril).

PRECAUCIÓN: El ingrediente principal de fijar es paraformaldehído, que es tóxica (inhalación, contacto de piel). Manéjela con cuidado.

1. Prepare una placa de fondo V bien 96 con 60 μL de tampón de arreglar I por pozo por muestra. Deje en el baño de agua de 37 ° C.
   Nota: Células: Solución buffer debe ser 1:1. Para permitir la evaporación a 37 ° C, el solución buffer es inicialmente en abundancia.
2. Opcionalmente, tratar las células con las drogas antes de la estimulación.
3. Transferir una muestra de 50 μl de control a la placa de la solución. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
4. Opcionalmente, inicie el curso del tiempo de estimulación mediante la adición de 10 μg/mL anti-IgM de las células. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
5. Transferir una muestra de 50 μl a la placa de la solución en cada momento. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
   Nota: Anti-IgM inducida por señales generalmente se inicia temprano (minutos).
6. Deje la placa de la solución a 37 ° C durante 10 min después de la última muestra se ha añadido.

5. el código de barras fluorescente de la célula (FCB)

Nota: Vea la tabla 1 para una lista de reactivos de código de barras.

1. Lavar las células fijadas 3 x con PBS (llenar los pozos).
2. Centrifugar a 500 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
3. Prepare una placa de fondo V bien 96 con reactivos de código de barras. Pipeta de 5 μl de cada reactivo de código de barras por pozo en el número de combinaciones para teñir las muestras siguiendo la matriz de la tinción, por ejemplo, en la figura 1B. Cada muestra tendrá una combinación única de código de barras diferentes concentraciones.
4. Resuspender las células en 190 μl de PBS y la transferencia a la placa de código de barras. Mezclar bien.
   Nota: Una muestra de compensación de la mancha con la más alta concentración final utilizada para cada reactivo de código de barras y guardar una muestra sin manchas.
5. Salir de las células durante 20 min a temperatura ambiente, en la oscuridad.
6. Lavar las células 2 x con lavado de flujo (PBS 1% FBS, 0,09% de azida sódica) (llenar los pozos).
7. Centrifugar a 500 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
8. Añadir 190 μl de flujo de lavado a las células y se combinan las muestras con código de barras en un tubo de 15 mL. Transferencia de cada control de compensación a un tubo separado 1,7 mL.
9. Centrifugar a 500 x g por 5 min descartar el sobrenadante.

6. permeabilización de la célula para la tinción de antígenos intracelulares

PRECAUCIÓN: El ingrediente principal de Perm Buffer III es el metanol que es tóxica (inhalación, contacto de piel) e inflamable. Manéjela con cuidado.

1. Transferir 2 mL de la ondulación permanente Buffer III a un tubo de 15 mL. Salir a-20 ° C por lo que es helada en uso.
   Nota: El búfer de la ondulación permanente puede dejarse en-20 ° C desde el comienzo del experimento.
2. Añadir 1,5 mL de tampón de Perm helada a la población de celular con código de barras (en un tubo de 15 mL) y 100 μl a cada control de compensación (en tubos de 1,7 mL) mediante goteo mientras Vortex para evitar que las células se agrupan juntos.
3. Transferir las células directamente a-80 ° C. Licencia por un mínimo de 30 minutos.
   Nota: Es natural para hacer una pausa en este punto el experimento. Células en Buffer Perm pueden ser almacenada a largo plazo a-80 ° C.

7. anticuerpos

Nota: Véase Tabla de materiales para obtener una lista de reportados anticuerpos fosfo-específicos.

1. Transferencia de las células de-80 ° C a una caja de hielo.
2. Lavar 3 x con flujo lavar.
   Nota: Es importante añadir lavado de flujo en exceso ver el precipitado de células, por ejemplo, añadir 3 mL de lavado de flujo a la población de celular con código de barras y 1 mL a cada control de compensación.
3. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
4. Resuspender la población de celular con código de barras en un volumen de lavado de flujo, que permite 25 μl de la suspensión celular por mancha de fosfo-anticuerpos. Resuspender los controles de compensación en 200 μL de lavado de flujo.
5. Preparación de anticuerpos para la tinción en un plato de fondo V bien 96. El volumen final será 50 μL/pocillo. Por pozo, añadir anticuerpos fosfo-específicos diluido en flujo de lavado hasta un volumen final de 10 μl, marcador superficial diluido en flujo de lavado hasta un volumen final de 15 μl y 25 μl de la suspensión celular.
   Nota: Las diluciones del anticuerpo deben titularse antes del experimento. Incluyen control de isotipo.
6. Salir de las células durante 30 min a temperatura ambiente, en la oscuridad.
7. Lavar las células 2 x con lavado de flujo (llenar los pozos).
8. Centrifugar a 500 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
9. Resuspender las células en 150 μL de lavado de flujo.

8. preparación de controles de compensación

1. Preparación de controles de compensación para los fluorocromos conjugados con anticuerpos en paralelo con la tinción de anticuerpos. Utilice cuentas de indemnización según las instrucciones del proveedor.

9. Análisis de citometría de flujo de

Nota: El experimento se puede ejecutar en un citómetro de flujo con un muestreador de alto de rendimiento (HTS).

1. Optimizar el voltaje de tubo (PMT) de fotomultiplicador con el control sin manchas.
2. Ejecutar controles de compensación y calcular la matriz de compensación.
3. Ejecutar ejemplos. La tasa de evento debe ajustarse a las especificaciones del instrumento.

10. estrategia y análisis de los datos que bloquean

1. Importar los archivos de la FCS en el experimento a un software de análisis de citometría de flujo como FlowJo o Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
2. Estrategia que bloquean
   1. Seleccionar los linfocitos mediante el trazado de SSC-A frente a FSC-A en una parcela de punto de densidad.
   2. Mostrar los linfocitos y seleccione los Maillots trazando SSC-A frente a FSC - W.
   3. Mostrar el células y la puerta de la celda tipo trazando SSC-A comparación con el marcador de superficie.
   4. Ver la población de tipo celular en el Pacífico azul versus densidad de SSC-A parcela y seleccionar las diferentes poblaciones de FCB basadas en su intensidad de la coloración azul del Pacífico (ver figura 1A).
   5. Trazar el canal de anticuerpo phospho contra el canal de la FCB, o como un mapa de calor (véase figura 1A) para mostrar los eventos de fosforilación.
3. Calcular usando el seno hiperbólico inverso (arcsinh) de la IMF (mediana intensidad fluorescente) de fosfo-señal frente a isotipo control fosfo-señales (niveles de fosforilación basal, ver figura 1), o estimulados frente a poblaciones de la célula sin estimular (véase la Figura 1E).

Results

Los pasos principales del Protocolo de citometría de flujo fosfo se ilustran en la figura 1A. En el ejemplo presentado, las células CLL se tiñeron con el reactivo de código de barras Pacífico azul en cuatro diluciones. El código de barras tridimensional se puede realizar mediante la combinación de tres tintes de código de barras, como se ilustra en la figura 1B. Las muestras individuales son entonces deconvoluted por sincronizaci...

Discussion

Phospho citometría de flujo es una técnica poderosa para medir los niveles de fosforilación de la proteína en las células. Puesto que el método se basa en la coloración con los anticuerpos, fosfo citometría de flujo está limitado por la disponibilidad de anticuerpos. Además, para obtener resultados fiables, todos los anticuerpos deben ser graduados y verificados antes de su uso. Un protocolo detallado para la titulación de anticuerpos fosfo-específicos ha sido descrito en otra parte¹². Durante el ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Medio de cultivo celular
Suero fetal bovino	ThermoFisher Scientific 10270169		Aditivo para el medio de cultivo celular
Piruvato de sodio	ThermoFisher Scientific	11360-039	Aditivo para el medio de cultivo celular
MEM aminoácidos no esenciales	ThermoFisher Scientific	11140-035	Aditivo para el medio de cultivo celular
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Medio de gradiente
de densidad Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	Para la estimulación del receptor de células B
BD Tampón de fijación de fosfaflujo I	BD 557870		Tampón de fijación
BD Phosflow Tampón de perm III	BD	558050	Tampón de permeabilización
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Reactivo de código de barras
Azul del Pacífico Éster de succinimidilo	ThermoFisher Scientific	P10163	Reactivo de código de barras Éster
succinimidilo de naranja del Pacífico, sal de trietilamonio	ThermoFisher Scientific	P30253	Reactivo de código de barras
Perlas de compensación	Definido por el usuario		Especie correcta reactividad
Tubos Falcon	Definido por el usuario
Tubos de Eppendorf	Definido por usuario
96 placas de fondo en V	Definido por el usuario		Compatible con el citómetro de flujo
Centrífugas	Definido por el usuario		Para tubos Eppendorf, tubos y placas Falcon
Baño de agua	Definido por el usuario		Citómetro de flujo regulado
	por temperaturaDefinido por usuario		Con muestreador de alto rendimiento (HTS)
Name	Company	Número de catálogo	>Comments
< strong>Antigen
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen…, Hematológica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
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Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone: J114-64 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
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NF-κ B p65 (pS536)	Cell Signaling Technologies	4887	Clone: 93H1 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone: 28B10 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endotelial …, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)	Cell Signaling Technologies	4375	Clone: E10 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
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p53 (pS37)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Duplicación de Flt3 Y591 y sobreexpresión de Bcl-2…, Sangre, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Tecnologías de señalización	NN	Clone: Policlonal Referencia: Irish et al., 2007, Duplicación de Flt3 Y591 y sobreexpresión de Bcl-2…, Sangre, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Tecnologías de señalización celular	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
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Rb (pS807/pS811)	Beckton Dickinson Pharmingen	558590	Clone: J112-906 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-ribos. Prot. (pS235/236)	Tecnologías de señalización	4851	Clone: D57.2.2E Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)	Tecnologías de señalización celular	9257	Clone: G9 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)	Beckton Dickinson Pharmingen	558438	Clone: J141-668.36.58  Referencia: Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)	Beckton Dickinson Pharmingen	612597	Clone: 4a  Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en …, Sangre, 129(6): 759-770
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STAT4 (pY693)	Zymed/ThermoFisher Scientific	71-7900	Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detección de STAT-4 fosforilado intracelular por citometría de flujo, Clin Immunol, 100(3): 270-6
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SYK (pY525/Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	Clone: C87C1 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Referencia: Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28 …, Biochem J, 460 (3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en …, Sangre, 129(6): 759-770