Aquí, se presenta un protocolo para el análisis de mediano a alto rendimiento eventos de fosforilación de proteínas a nivel celular. Citometría de flujo de fosfo es un enfoque potente para caracterizar las aberraciones señalización, identificar y validar biomarcadores y Evaluación farmacodinámica.
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Artículo de método
Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores
En este artículo
Resumen
Resumen
Señalización celular aberrante desempeña un papel central en el desarrollo del cáncer y la progresión. Terapias dirigidas más nuevas son de hecho dirigidas a proteínas y funciones de la proteína, y aberraciones señalización celular por lo tanto pueden servir como biomarcadores para indicar las opciones de tratamiento personalizado. En contraposición a los análisis de ADN y ARN, cambios en la actividad de la proteína pueden evaluar más eficazmente los mecanismos subyacentes de resistencia y sensibilidad de la droga. Phospho citometría de flujo es una técnica poderosa que mide eventos de fosforilación de proteínas a nivel celular, una característica importante que distingue a este método de otros enfoques basados en anticuerpos. El método permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas de señalización. En combinación con códigos de barra fluorescente de la célula, más grande de los conjuntos de datos de mediano a alto rendimiento pueden ser adquiridos por el citómetro estándar hardware en poco tiempo. Citometría de flujo fosfo tiene aplicaciones en estudios de biología básica y en investigación clínica, incluyendo análisis, descubrimiento de biomarcadores y la evaluación de la farmacodinámica de la señalización. Aquí, se proporciona un protocolo experimental detallado para fosfo análisis de flujo de células mononucleares de sangre periférica purificada, usando las células de la leucemia linfocítica crónica por ejemplo.
Introducción
Phospho citometría de flujo se utiliza para analizar los niveles de fosforilación de la proteína unicelular resolución. El objetivo del método es asignar patrones de señalización celulares bajo condiciones especificadas. Aprovechando la capacidad multiparamétrico de citometría de flujo, varias vías de señalización se pueden analizar simultáneamente en diferentes subconjuntos de una población celular heterogénea como la sangre periférica. Estas características ofrecen ventajas sobre otras tecnologías basadas en anticuerpos como inmunohistoquímica, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), matriz de proteína y fase inversa proteína matriz (RPPA)
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Protocolo
Muestras de sangre fueron recibidas tras consentimiento informado por escrito de todos los donantes. El estudio fue aprobado por el Comité Regional de médicos y de salud investigación ética de suroriental Noruega y se llevó a cabo la investigación sobre la sangre humana con arreglo a la declaración de Helsinki8.
Nota: Pasos 1-3 deben realizarse bajo condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos.
1. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de muestras de sangre de pacientes de CLL
PRECAUCIÓN: Sangre humana debe....
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Resultados
Los pasos principales del Protocolo de citometría de flujo fosfo se ilustran en la figura 1A. En el ejemplo presentado, las células CLL se tiñeron con el reactivo de código de barras Pacífico azul en cuatro diluciones. El código de barras tridimensional se puede realizar mediante la combinación de tres tintes de código de barras, como se ilustra en la figura 1B. Las muestras individuales son entonces deconvoluted por sincronizaci.......
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Discusión
Phospho citometría de flujo es una técnica poderosa para medir los niveles de fosforilación de la proteína en las células. Puesto que el método se basa en la coloración con los anticuerpos, fosfo citometría de flujo está limitado por la disponibilidad de anticuerpos. Además, para obtener resultados fiables, todos los anticuerpos deben ser graduados y verificados antes de su uso. Un protocolo detallado para la titulación de anticuerpos fosfo-específicos ha sido descrito en otra parte12. Durante el .......
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio del profesor Kjetil Taskén y fue apoyado por la sociedad de cáncer de Noruega y Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron y Marianne Enger son reconocidos por la lectura crítica del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Medio de cultivo celular |
| Suero fetal bovino | ThermoFisher Scientific 10270169 | Aditivo para el medio de cultivo celular | |
| Piruvato de sodio | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Aditivo para el medio de cultivo celular |
| MEM aminoácidos no esenciales | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Aditivo para el medio de cultivo celular |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Medio de gradiente |
| de densidad Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | Para la estimulación del receptor de células B |
| BD Tampón de fijación de fosfaflujo I | BD 557870 | Tampón de fijación | |
| BD Phosflow Tampón de perm III | BD | 558050 | Tampón de permeabilización |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Reactivo de código de barras |
| Azul del Pacífico Éster de succinimidilo | ThermoFisher Scientific | P10163 | Reactivo de código de barras Éster |
| succinimidilo de naranja del Pacífico, sal de trietilamonio | ThermoFisher Scientific | P30253 | Reactivo de código de barras |
| Perlas de compensación | Definido por el usuario | Especie correcta reactividad | |
| Tubos Falcon | Definido por el usuario | ||
| Tubos de Eppendorf | Definido por usuario | ||
| 96 placas de fondo en V | Definido por el usuario | Compatible con el citómetro de flujo | |
| Centrífugas | Definido por el usuario | Para tubos Eppendorf, tubos y placas Falcon | |
| Baño de agua | Definido por el usuario | Citómetro de flujo regulado | |
| por temperaturaDefinido por usuario | Con muestreador de alto rendimiento (HTS) | ||
| Name | Company | Número de catálogo | >Comments |
| < strong>Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen…, Hematológica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Referencia: Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endotelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en …, Sangre, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Referencia: Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en …, Sangre, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Referencia: Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Referencia: Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| Iκ B&alfa; | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Referencia: Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en …, Sangre, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Referencia: Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κ B p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κ B p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endotelial …, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Tecnologías de señalización | NN | Clon: 16G8 Referencia: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicación y sobreexpresión de Bcl-2…, Sangre, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Tecnologías de señalización | NN | Clone: Polyclonal Referencia: Irish et al., 2007, Duplicación de Flt3 Y591 y sobreexpresión de Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Duplicación de Flt3 Y591 y sobreexpresión de Bcl-2…, Sangre, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Tecnologías de señalización | NN | Clone: Policlonal Referencia: Irish et al., 2007, Duplicación de Flt3 Y591 y sobreexpresión de Bcl-2…, Sangre, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Tecnologías de señalización celular | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ 2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en …, Sangre, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-ribos. Prot. (pS235/236) | Tecnologías de señalización | 4851 | Clone: D57.2.2E Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Tecnologías de señalización celular | 9257 | Clone: G9 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Referencia: Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en …, Sangre, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detección de STAT-4 fosforilado intracelular por citometría de flujo, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en…, Sangre, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Referencia: Skå nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28 …, Biochem J, 460 (3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en …, Sangre, 129(6): 759-770 |
Referencias
- Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P.
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Reimpresiones y permisos
