Un protocolo detallado para un panel de inmunofluorescencia multiplex marcador seis es optimizado y realizado, utiliza un teñidor automático para resultados más consistentes y un menor tiempo de procedimiento. Este enfoque puede adaptarse directamente por cualquier laboratorio para estudios de inmuno-Oncología.
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Artículo de método
Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma
En este artículo
Resumen
Resumen
Continua evolución de inmuno-Oncología requiere una mayor comprensión de los mecanismos de la inmunología del cáncer. El análisis immunoprofiling de muestras de tejido de biopsias de formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) se ha convertido en una herramienta clave para entender la complejidad de la inmunología tumoral y descubrimiento de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer. Immunoprofiling análisis de los tejidos requiere la evaluación de marcadores combinados, incluyendo las subpoblaciones de células inflamatorias y los puestos de control inmunes en el microambiente del tumor. El advenimiento de métodos inmunohistoquímicos multiplex novela permite un más eficiente Análisis multiparamétrico de secciones del tejido fino solo que hace estándar monoplex immunohistochemistry (IHC). Una inmunofluorescencia múltiplex disponible comercialmente (si) método se basa en la amplificación de la señal tyramide y, combinado con el análisis microscópico multiespectral, permite una mejor separación de señal de diversos marcadores en el tejido. Esta metodología es compatible con el uso de anticuerpos primarios no conjugados que se han optimizado para IHC estándar en las muestras de tejido FFPE. Adjunto describimos detalladamente un protocolo automatizado que permite multiplex si el etiquetado de las muestras de tejido de carcinoma con un panel de anticuerpos multiplex marcador seis compuesto por PD-L1, 1 PD, CD68, CD8, Ki-67 y citoqueratinas AE1/AE3 con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole como una contratinción nuclear de la célula. El protocolo multiplex panel está optimizado en un teñidor automático de IHC para un tiempo de tinción es más corto que el del protocolo manual y directamente aplicado y adaptado por cualquier investigador de laboratorio para estudios de inmuno-Oncología en muestras humanas de tejido FFPE. También se describe son varios controles y herramientas, incluyendo un método de control de gota fina control de calidad de un nuevo panel multiplex de IF, que son útiles para la optimización y validación de la técnica.
Introducción
Immunoprofiling análisis de muestras de tejido FFPE tumor se ha convertido en un componente esencial de los estudios de inmuno-Oncología, particularmente para el descubrimiento y validación de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer en el contexto de ensayos clínicos1 ,2. IHC cromogénica, utilizando químicos cromógenos como diaminobenzidina, sigue siendo la técnica estándar en patología diagnóstica de la inmunomarcación de biopsia del tejido3. IHC estándar puede usarse también para immunoprofiling de tejido de cáncer, incluyendo la cuantificación de subpoblaci....
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Protocolo
Nota: El protocolo que presentamos describe cómo se realiza la immunoprofiling de un grupo de mIF con TSA para seis anticuerpos (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 y AE1/AE3) en un stainer automatizado (véase Tabla de materiales). El protocolo también describe cómo realizar los controles de la caída de un control de calidad de un nuevo panel de FOMIN (ver Materiales complementarios). En este protocolo de tinción se realiza con ocho diapositivas FFPE sin mancha de la amígdala humana (control positivo) y ocho diapositivas sin manchas de adenocarcinoma pulmonar humano. La primera diapositiva se utiliza para el múltiplex comple....
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Resultados
El protocolo descrito aquí proporcionará resultados como los mostrados en la figura 2. Comenzar con una evaluación de la tinción en el control de la amígdala, comenzando con el epitelio escamoso superficial. La histología de la muestra de la amígdala puede ser revisada con un patólogo, haciendo referencia a la diapositiva de H & E. Si secciones IHC cromogénicos se realizan con los mismos marcadores en el mismo bloque de tejido, entonces estos pueden utili.......
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Discusión
La revolución de la inmunoterapia de cáncer curso es apertura nuevas y prometedoras opciones terapéuticas para pacientes de cáncer13. Avances en el campo de la inmuno-Oncología requiere mayor conocimiento del microambiente del tumor inflamatorio, no sólo para entender la biología de los mecanismos inmunológicos involucrados en la carcinogénesis pero también para encontrar biomarcadores predictivos para el nuevo tratamientos basados en inmunoterapia1,
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Divulgaciones
Este trabajo fue apoyado por MedImmune, el biologics global R & D arm de AstraZeneca. C.W., K.R. y C.C.H. son empleados de Perkin Elmer, que produce los reactivos (kit de la TSA) y escáneres multiespectrales que se utilizaron en este trabajo. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. y J.R.C. son empleados de MedImmune con participación o intereses comunes o las opciones en AstraZeneca.
Agradecimientos
Apoyo editorial fue proporcionada por Deborah Shuman de MedImmune.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Software "InForm 2.4.2" para la desmezcla espectral y el análisis de imágenes | PerkinElmer | CLS151066 | llamado "software de desmezcla espectral" en el texto |
| "Phenochart 1.0.9" Software QPTIFF para la selección de MSI y la visualización general del escaneo de diapositivas | PerkinElmer | CLS151067 | llamado "software QPTIFF" en el texto |
| #1.5 Cubreobjetos | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| Etanol de 200 pruebas | Koptec | V1001 | |
| 20x solución salina tamponada Tris | VWR | J640-4L | |
| Diluyente de anticuerpos | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Monoclonal | de ratón DAKO | M087601-2 | Clon PG-M1 |
| Anti-CD8 Conejo Monoclonal | Ventana | M5392 | Clon SP239 |
| Anti-CK Monoclonal | de ratónDAKO | M351501-2 | Clon AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Ratón Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clon MIB-1 |
| Anti-PD-1 Conejo Señalización de células monoclonales | #86163 | Clon D4W2J | |
| Anti-PD-L1 Conejo Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clon SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Llamado "solución de desparafinado" en texto |
| Solución de recuperación de epítopos de enlace 1 | Leica | AR9961 | llamada "ER1" en texto |
| Solución de recuperación de epítopos de enlace 2 | Leica | AR9640 | llamada "ER2" en texto |
| Contenedores abiertos de enlace, 30 mL | OP309700 Leica | llamados "Contenedores abiertos de 30 mL" en texto | |
| Contenedores abiertos de bond, 7 mL | OP79193 Leica | llamados "Contenedores abiertos de 7 mL" en el texto | |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Llamado "kit de detección cromogénica" en el texto |
| Bond Kit | de investigación Leica | DS9455 | Llamado "kit de detección de investigación" en el texto |
| Kit de valoración de unión | Leica OPT9049 | Llamado "kit de valoración" en el texto | |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Llamado "covertiles" en texto |
| Bond Wash Solution 10X Concentrado | Leica | AR9590 | Llamado "10x wash solution" en texto |
| BondRX Autostainer | Leica | Llamado "tinción automatizado" en texto | |
| Software BondRX Versión 5.2.1.204 | Leica | Llamado "software de tinción automatizado" en texto | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Llamado "kit de tinción multiespectral" en el texto |
| Bloque de peroxidasa | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade | Mountant Thermo | P36965 | Llamado "montaje de diapositivas" en el texto |
| Starfrost | Slides Fisher | 15-183-51 | |
| Microscopio multiespectral Vectra Polaris con software "Vectra 3.0.5" para el control de microscopio multiespectral | PerkinElmer | CLS143455 | Llamado "software de control de microscopio" en el texto |
Referencias
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications....
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Reimpresiones y permisos
