Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente a núcleos de alta calidad del tejido fresco o congelado para la descendente secuencia de RNA masivamente paralelo. Nos incluyen tejido detergente-mecánica y de mecánica hipotónica interrupción y célula opciones de lisis, que pueden utilizarse para el aislamiento de los núcleos.
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Artículo de método
Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN
En este artículo
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Resumen
Resumen
Sondeo de genes de una célula individual permite la identificación del tipo celular y el estado de la célula. La secuencia de RNA unicelular ha surgido como una poderosa herramienta para el estudio de perfiles transcripcionales de las células, particularmente en tejidos heterogéneos tales como el sistema nervioso central. Sin embargo, métodos de disociación para la secuencia de la célula pueden conducir a cambios experimentales en la gene expresión y muerte celular. Además, estos métodos están generalmente restringidos a tejido fresco, limitando así los estudios sobre archivos y material bio-Banco. Solo núcleo RNA secuencia (snRNA-Seq) es una alternativa atractiva para estudios transcripcionales, dado que precisamente identifica tipos de la célula, permite el estudio de los tejidos congelados o difícil de disociar, y reduce la disociación inducida transcripción. Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para el aislamiento rápido de núcleos para abajo snRNA-SS. Este método permite el aislamiento de los núcleos de las muestras frescas o congeladas de la médula espinal y puede combinarse con dos plataformas de encapsulación de gota masiva y en paralelo.
Introducción
El sistema nervioso se compone de grupos heterogéneos de células que muestran una gran variedad de propiedades morfológicas, bioquímicas y electrofisiológicas. Mientras que la secuencia de RNA a granel ha sido útil para determinar cambios de todo el tejido en la expresión de genes en diferentes condiciones, excluye la detección de cambios transcripcionales a nivel unicelular. Los avances recientes en el análisis transcripcional unicelulares han permitido la clasificación de las células heterogéneas en grupos funcionales basados en su repertorio molecular e incluso se pueden aprovechar para detectar grupos de neuronas que habían sido recientemente activas.
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Protocolo
Todos los trabajos de animales se realizan según un protocolo aprobado por el Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y movimiento Animal cuidado y uso. Equilibrado de las muestras de hombres y mujeres ICR/CD-1 tipo salvaje ratones, entre 8 y 12 semanas viejo, fueron utilizados para todos los experimentos. Ratones deben ser manejados con arreglo a directrices institucionales Animal Care y Comité de uso locales.
1. preparación de materiales y Buffers
- Preparar todos los búferes del día de uso y enfriado previamente en hielo (ver tabla 1).
- Si utiliza detergente industrial lisis, preparar el tampón de li....
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Resultados
Aquí, realizamos aislamiento de núcleos de la médula espinal lumbar ratón adulto para la descendente secuencia de RNA masivamente paralela. El protocolo participan tres componentes principales: tejido celular e interrupción lisis, homogeneización y sacarosa densidad centrifugación (figura 1). En cuestión de segundos la lisis mecánica de detergente rindió una preparación cruda de núcleos con un gran número de núcleos, así como desechos celulares y del tejido (.......
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Discusión
El objetivo final de este protocolo es aislar a los núcleos que contienen RNA de alta calidad para posteriores análisis transcripcional. Adaptamos métodos snRNA-Seq para Perfil de todos los tipos de células en la médula espinal. Inicialmente, se encontró que célula típica disociación métodos eran ineficaces para secuenciación unicelular RNA, como las neuronas de la médula espinal son especialmente vulnerables a la muerte celular. Además, métodos de disociación celular inducen la expresión de varios genes de la respuesta .......
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Divulgaciones
No tenemos conflictos de interés que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el programa intramuros de NINDS (1 ZIA NS003153 02) y NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li y C.I. Dobrott por su apoyo técnico y discusiones útiles y C. Kathe para revisar el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sacarosa Invitrogen | 15503-022 | ||
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Añadir DTT justo antes |
| de usar Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Agua sin nucleasas | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7,4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/ μ L Inhibidor de ARNasa | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Tubo de centrífuga | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Desechable Algodón Tapón de Borosilicato-Vidrio Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 mL) | Kimble | 885303-002 | |
| Vidrio gran espacio libre | Majble | Kimble 885301-0002 | |
| Mortero de vidrio Kimble | 885302-002 | ||
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogeneizador | IKA | 3737001 | |
| Herramienta de dispersión (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Tinte azul de tripán (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μ m colador de celdas | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μ m | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Tubos cónicos | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Rotor de ángulo fijo | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Pipetas estereológicas: 5 mL, 10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocitómetro | Daigger Scientific EF16034F | ||
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap Solución de descontaminación de RNasa | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Tubo de ensayo con tapa de filtro de células (35 μ m) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3' Kit de bolas de biblioteca y gel v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics Plato de | ||
| tejidos (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
Referencias
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
