Artículo de método

Monitoreo de Hippo señalización vía actividad utilizando un Biosensor de luciferasa basado gran Tumor supresor (LATS)

DOI:

10.3791/58416

⸱

13 de septiembre de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un biosensor basado en luciferase para cuantificar la actividad quinasa de supresor de tumor grande (LATS)-una quinasa central en la vía de señalización de hipopótamo. Este biosensor tiene diversas aplicaciones en investigación básica y traslacional destinada a investigar Hippo vía reguladores en vitro e in vivo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El hipopótamo vía de señalización es un regulador conservado de tamaño del órgano y tiene importantes funciones en la biología del desarrollo y cáncer. Debido a problemas técnicos, sigue siendo difícil evaluar la actividad de esta vía de señalización e interpretar en un contexto biológico. La literatura existente sobre supresor de tumor grande (LATS) se basa en métodos que son cualitativos y no pueden ser escalado-para arriba fácilmente para la detección. Recientemente, hemos desarrollado un biosensor basado en la bioluminiscencia para monitorear la actividad quinasa de componente LATS-a base de la cascada de quinasa de hipopótamo. Aquí, describen los procedimientos para cómo este biosensor letón (Letón-BS) se puede utilizar para caracterizar los reguladores vía de hipopótamo. En primer lugar, proporciona un protocolo detallado para investigar el efecto de un candidato de Proteína sobreexpresada (p. ej., VEGFR2) actividad LATS utilizando el LATS-BS. A continuación, mostramos cómo la LATS-BS se puede utilizar para una pantalla de inhibidor de la cinasa en pequeña escala. Este protocolo viable puede ser escalado-para arriba para realizar pantallas más grandes, que sin duda identificará nuevos reguladores de la vía Hipona.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El hipopótamo señalización camino primero fue identificado en Drosophila como un nuevo regulador del crecimiento celular y animal tamaño1,2. Desde su descubrimiento inicial, pruebas de montaje ha demostrado convincentemente que la vía Hipona juega papeles críticos en el desarrollo (p. ej., desarrollo embrionario, control del tamaño del órgano y morfología tridimensional de [3D]), (tumorigénesis por ejemplo, desarrollo de tumores, metástasis, angiogénesis, evasión inmune, inestabilidad genómica, respuesta de estrés y resistencia a los medicamentos) y la homeostasis del tejido (por ejemplo, renovación de células madre y la diferenciación y regeneración de los tejidos después de la lesión) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. señalización de hipopótamo es con frecuencia existen varios tipos de cáncer7,8,9,10,11,12. Por lo tanto, dilucidar las funciones de la vía Hipona en Biología del cáncer y terapéutica y medicina regenerativa se ha convertido en una de las zonas más calientes en la investigación biomédica.

En síntesis, en el camino de hipopótamo, al activarse por reguladores de arriba (p. ej., contacto célula-célula, nutrimentos y matriz extracelular [MEC]), quinasas de serina/treonina (S/T) MST1/2 (MST; homólogos mamíferos del hipopótamo de Drosophila ) fosforilan o activar adaptador las proteínas hMOB1 y WW45, así como las quinasas LATS1/2 (LATS) que, posteriormente, fosforilan coactivador transcripcional YAP y su paralog TAZ en HX(H/R/K)XX(S/T) conservado (H, histidina; R, arginina; K, lisina; S, serina; T, treonina; X, cualquier aminoácidos) motivos, incluyendo YAP-S127 y TAZ-S8911,12. S127-phosphorylated YAP (YAP-pS127) y S89-phosphorylated TAZ (TAZ-pS89) son degradados por ubiquitinación o se unen a la proteína citoplásmica 14-3-3 y se les impide interactuar con TEAD1-4 factores de transcripción en el núcleo al transactivate aguas abajo genes implicados en la proliferación celular y apoptosis (figura 1). A pesar del enorme interés en el camino de hipopótamo, existen pocas herramientas para medir el hipopótamo señalización y aquellos que se han limitado históricamente a los periodistas de producción transcripcional YAP/TAZ/TEAD. De hecho, hasta hace poco, había no hay herramientas para medir la dinámica y actividad del hipopótamo componentes de señalización de manera cuantitativa en tiempo real, alto rendimiento y no invasiva tanto in vitro como in vivo.

Dada nuestra comprensión del papel de las interacciones de la proteína-proteína en fisiología y patología emergente, hay gran interés en el desarrollo de herramientas que pueden utilizarse para el estudio de estas interacciones en una manera cuantitativa y en tiempo real13, 14,15,16. De hecho, ha habido un progreso significativo en el desarrollo de estrategias de bio-analíticos, incluyendo la levadura dos híbridos (Y2H)17el plasmón superficial (SPR) de resonancia18y Förster Resonancia energética transferencia (traste)19 ensayos, evaluar las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, estos enfoques llevan la limitación de requerir significativa optimización de la orientación de reportero, tal que muchas construcciones, deberán analizarse para encontrar una eficiente. Además, estos enfoques también tienen una relativamente baja relación señal a ruido, que puede ser difícil discernir una señalización positiva verdadera.

Ensayos de complementación de proteínas se desarrollaron para superar estas limitaciones. La primera generación de ensayos de complementación de proteínas fue basada en split fluorescencia multicolor proteínas y no podrían solucionar las limitaciones mencionadas20. Las proteínas de la fluorescencia multicolora consisten en solamente un dominio, lo que es difícil de separar en dos fragmentos separados estables con baja afinidad y ruido de fondo21. Posteriormente, la luciferasa de la luciérnaga fue identificado como un nuevo candidato para el uso en el desarrollo de ensayos de complementación de proteínas split. En este enfoque, la luciferasa de la luciérnaga se divide en dos fragmentos (N-terminal y c-terminal luciferase [NLuc y CLuc]) con cada fragmento unida a una proteína diana de interés. Si el NLuc y CLuc se traen en proximidad a la interacción de las proteínas dos blanco, actividad de luciferasa se reconstituye y se genera la luz bioluminiscente en presencia de sustrato luciferin y22de la ATP. En 2001, realizando una proyección combinatoria utilizando una biblioteca que contiene fragmentos de NLuc y CLuc en varios sitios y unido a proteínas con diferentes conectores, Paulmurugan y Gambhir en Universidad de Stanford desarrollaron un split-firefly optimizado sistema de complementación asistida fragmento luciferase de interacciones proteína-proteína23. En este sistema, luciferasa de la luciérnaga se corta de aminoácidos (aa) 398 NLuc y CLuc, que se unen a dos proteínas de interés utilizando a un linker flexible de ocho residuos de glicina y dos residuos de serina.

Utilizando un enfoque similar, recientemente desarrollamos un nuevo LATS-BS fundiendo NLuc a 15 aa de YAP que rodea el sitio de fosforilación de LATS en S127 (YAP15) y CLuc con 14-3-3. La proteína integral de YAP no fue utilizada, para evitar confundir las señales por modificaciones post-traduccionales de YAP (p. ej., fosforilación en otros sitios y ubiquitinación) por otros reguladores de aguas arriba. El LATS-BS presentados aquí no invasiva puede monitorear Hippo actividad de señalización tanto in vitro en células vivas y en vivo en ratones20,24 (figura 2). Aquí, describimos un protocolo detallado para medir LATS kinase actividad en vitro usando el LATS-BS. En primer lugar, mostramos cómo la LATS-BS se puede utilizar para investigar el efecto de una proteína sobreexpresada en la actividad LATS. A continuación, mostramos cómo el biosensor se puede utilizar para supervisar la actividad de la vía Hipona después del tratamiento con los agentes que regulan la vía Hipona. Este protocolo podría utilizarse para identificar y caracterizar la señalización vías o estímulos regulan actividad de quinasa LATS.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. la investigación de un supuesto regulador de Hippo señalización utilizando el LATS-BS

  1. Galjanoplastia y transfección de las células
    1. Preparación del cultivo celular
      1. Caliente 1 x PBS DMEM con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina y 0.25% tripsina-EDTA a 37 ° C en un baño de agua durante aproximadamente 30 minutos.
      2. Limpiar un gabinete de bioseguridad con etanol al 70%.
      3. Colocar platos de cultivo de tejidos, Pipetas Pasteur, pipetas y puntas de pipeta en la campana de cultivo de tejidos como sea necesario.
      4. Sacar 1 x PBS, los medios de comunicación y el tripsina-EDTA del baño limpiar con etanol al 70% y colóquelos en la campana.
    2. Mantenimiento y revestimiento de las células para transfección
      1. Elija una línea celular con una eficacia de transfección alta (p. ej., HEK293) para el experimento. Busque la expresión de componentes del camino de hipopótamo en esta línea celular mediante western blot Hippo señalización esté activo.
      2. Crecen las células HEK293 en DMEM en cajas Petri de 10 cm en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Seguimiento de las células bajo el microscopio cada día. Paso de las células como se describe a continuación cuando se observa la confluencia de 80-90%.
      3. Lavar las células añadiendo 5 mL de PBS 1 x en una placa, girando suavemente la placa, y aspirando los medios de comunicación completamente.
      4. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA a la placa. Remolino de la placa para asegurar que la tripsina uniformemente cubre las células.
      5. Incube las células a 37 ° C en un incubador de CO2 durante 5 minutos o hasta que todas las células son separadas.
      6. Añadir 4 mL de medio (con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina) a neutralizar la tripsina, resuspender las células mediante pipeteo arriba y abajo varias veces y dispensar una décima (0,5 mL) de las células en nuevas placas de 100 mm (para una relación de paso de 1:10) con 9,5 mL de completar los medios de comunicación.
      7. Para transfección de LATS-BS , contar las células usando un hemocitómetro y placa 2 x 105 células en cada pozo de una placa de 12 pozos 24 h antes de transfección.
        Nota: Uso de mayor número de células puede aumentar la señal de fondo bioluminiscente como hipopótamo de señalización actividad está regulada por la confluencia de la célula. Utilizando un menor número de células puede aumentar la sensibilidad celular a reactivos de transfección y aumento de muerte celular24.
    3. Transfección de LATS-BS solo o junto con el gen candidato
      1. Fresco de cultivo líquido de bacterias DH5a (necesario para lograr una óptima expresión de LATS-BS) en Miniprep LATS-BS plásmidos (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro y 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro).
      2. 1 h antes de la transfección, aspirar el medio de la placa, Añadir 500 μl de medio de cultivo completo en cada pocillo de las placas de 12 pozos y volver las células a la incubadora.
        Nota: El siguiente protocolo describe métodos de transfección con un reactivo de transfección con polímeros comercialmente disponibles. Otros reactivos de transfección pueden ser también adecuados para transfección; sin embargo, no hemos todavía probado les.
      3. Hacer soluciones A y B como se describe en la tabla 1. Para transfecciones N, hacer (N + 0,5) x premezcla solución B.
      4. Inmediatamente añadir el reactivo de transfección de polímero diluido (solución B) ADN (solución A). Pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar.
      5. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 min permitir complejos de transfección para formar.
      6. Añadir el volumen total (76 μL) de complejos de transfección gota a gota en cada pocillo de la placa de 12 pozos con agitación suave.
      7. Incube las células durante la noche (18 – 24 h) a 37 ° C.
        Nota: Para las células que son sensibles a reactivos de transfección con polímeros, puede reducirse el tiempo de incubación a 5 h.
      8. El día después de la transfección, eliminar los medios de comunicación que contiene el complejo de transfección y sustituirla por medio completo fresco. Las células a 37 ° C para otro día realizar el ensayo de luciferasa de la cultura.
  2. Ensayo de luciferasa
    Nota: El sistema de ensayo de reportero de luciferasa detección de firefly y Renilla juntos en un ensayo se utiliza para los ensayos de la luciferasa. Si Renilla no se usó como control interno, realizar ensayo de luciferasa de un solo paso mediante la adición de LARII sin necesidad de añadir el reactivo de detección Renilla .
    1. Preparación de los lysates de la célula
      1. Diluir 5 tampón de lisis pasivo x (PLB) con agua destilada como sigue:
      2. Volumen total de 1 x PLB requerido = N x (50 μL de 5 x PLB) + 200 μL de dH2O = μL de N x 250 de 1 x PLB por pocillo de las placas de 12 pozos (N = número de muestras).
      3. Aspire completamente los medios de comunicación. Añadir 1 mL de 1 x PBS a cada pocillo. Agitar la placa suavemente para quitar separado células y medios de crecimiento residual. Aspire completamente el PBS 1 x. No Asegúrese de que ningún residual 1 x PBS restos antes de la adición de 1 x PLB.
      4. Añadir 250 μL de 1 x PLB/bien.
      5. Colocar las placas en una plataforma oscilante con balanceo suave para asegurar una cobertura completa e incluso de la monocapa de células con 1 x PLB. Roca de las placas de cultivo a temperatura ambiente durante 15 minutos permitir que las células se Lisan.
      6. Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Medición de la señal bioluminiscente
      1. Sacar el LARII (20 μL/muestra) de-80 ° C y se equilibren a temperatura ambiente.
      2. Preparar reactivo de detección Renilla N ensayos: Añadir (N + 1) x 0,4 μL de 50 x sustrato a (N + 1) x 19.6 μL de su tampón.
      3. Predispense 10 μL de cada celda lisado a tubos de 1,5 mL.
      4. Programa un luminómetro para llevar a cabo un retraso premeasurement de 2 s, seguido por un período de medición 10 s para cada ensayo de luciferasa dual.
        Nota: Las mediciones del primeras y segunda se ser correspondiente a la señal de LATS-BS y la señal de control interno Renilla , respectivamente. Puede utilizarse cualquier luminómetro compatible con una luciferasa simple o doble.
      5. Cuidadosamente transfiera 20 μL del reactivo LARII un tubo y pipeta rápidamente arriba y abajo 3 x para mezclarlo.
      6. Inmediatamente Coloque el tubo en el luminómetro e iniciar la lectura.
      7. Retirar el tubo de muestra del luminómetro, añadir 20 μL del reactivo de Renilla y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 3 x. Traer la muestra en el luminómetro e iniciar la siguiente lectura. Registrar las mediciones.
      8. Deseche el tubo de reacción y proceder a la siguiente muestra.

2. una pantalla para identificar Hippo vía reguladores utilizando el LATS-BS

  1. Cultivo celular y transfecciones
    1. Células de HEK293AD de cultura como se describe en el punto 1.1.
      Nota: HEK293AD es más adherente que otras líneas de células HEK293, que hace una línea de buen celular para su uso en pantallas.
    2. Separar las células como se describe en la sección 1.1.2. Contar y placa 2 x 106 células en placas de 100 mm 24 h antes de la transfección.
    3. 1 h antes de la transfección, aspirar los medios de comunicación de la placa y reemplazarlos con 5 mL de medio fresco crecimiento completo.
    4. Hacer soluciones A y B como se describe en la tabla 2.
    5. Inmediatamente añadir el reactivo de transfección de polímero diluido (solución B) ADN (solución A). Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    6. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 min permitir complejos de transfección para formar.
      1. Añadir el volumen total (500 μl) de complejos de transfección gota a gota a las células con agitación suave.
      2. Incube las células durante la noche a 37 ° C.
      3. Al día siguiente, trypsinize y contar las células. Placa de 1 x 104 2 x 104 células en cada pozo de una placa de 96 pocillos en un volumen total de 100 μl de medio por pozo. Incubar durante otro día.
    7. Al día siguiente, añadir moléculas de pequeños agentes regulando la vía Hipona a una concentración final de 10 μm en cada pocillo, 1-4 h antes de realizar el ensayo de luciferasa.
      Nota: Para los más pequeños moléculas/agentes, un tratamiento de 4 h en 10 μm no afecta viabilidad celular. Si se utiliza una concentración menor, tratamiento puede prorrogarse por un período más largo de tiempo.
  2. Ensayo de luciferasa
    1. In vitro ensayo de luciferasa
      1. Aspire completamente los medios de comunicación de las células. Lavar las células con 100 μl de 1 x PBS en cada pocillo. Aspire completamente.
      2. Añadir 20 μl de 1 x PLB (preparado como se describe en paso 1.2.1.1) en cada pocillo de las placas de 96 pocillos.
      3. Coloque las placas en una plataforma oscilante con balanceo suave a temperatura ambiente durante 15 minutos.
      4. Cuidadosamente transfiera 20 μl del reactivo LARII en cada pozo y pipetear arriba y abajo 3 x para mezclar.
      5. Inmediatamente colocar la placa en un luminómetro de placa-lectura e iniciar la lectura.
    2. Ensayo de luciferasa de célula de vida
      1. Hacer 11 x stock luciferin D como sigue: disolver 1,5 mg de polvo D luciferin en 1 mL de medio de cultivo normal.
      2. Transferir 10 μl de x 11 D-luciferin en cada pozo y mezclar suavemente con los medios de comunicación que ya está en el pozo.
      3. Vuelva a colocar las células en la incubadora durante 10 minutos.
      4. Colocar la placa en el luminómetro e iniciar la lectura.
        Nota: Si la intensidad no es lo suficientemente fuerte en esta concentración de D-luciferin, puede añadirse otro 10 μl del stock D luciferin a las células.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El LATS-BS fue cotransfected con genes diversos para evaluar su efecto sobre la actividad LATS (figura 3). En este experimento, Renilla se utilizó como control interno. La expresión transitoria de YAP-5SA, una forma activa constitutiva de YAP, aumentando los niveles de objetivos transcripcionales YAP y un aumento subsecuente en actividad de la cinasa LATS a través de una vía de retroalimentación establecido25causas. MST, el ac...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mientras que la vía Hipona juega un papel fundamental en diversos procesos biológicos, y la desregulación de la vía Hipona conduce a cáncer6, cómo se regula la vía Hipona en respuesta a varios estímulos no se entiende totalmente. Además, no ha habido ningún sistema cuantitativo y en tiempo real para evaluar la actividad de componentes principales de hipopótamo. Recientemente, hemos desarrollado y había validado un nuevo biosensor para la medición de actividad de la cinasa del letón en el hipopótam...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la canadiense Instituto de investigación en salud (CIHR #119325, 148629) y la Fundación Canadiense de cáncer de mama (CBCF) a XY. TA es apoyado por la beca postgrado Vanier Canadá y la beca de postgrado de internacional de Ontario. HJJVR es apoyado por una beca de posgrado Reina Elizabeth II en ciencia y tecnología.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tripsina-EDTA  Life Technologies25200560.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF1051
DMEMSigmaD6429-500mlDMEM con alto contenido de glucosa 
de penicilina fuerteLife Technologies15140122
PolyJet In Vitro Reactivo de transfección de ADN  SignagenSL100688.5
5x Tampón de lisis pasivoPromegaE194A30 ml
Dual-Glo® Sistema de ensayo de luciferasaPromegaE2940kit de 100 ml
20/20 luminómetroTurner Biosystems998-2036Luminómetro lector de un solo tubo
GloMax® Navegador con inyectores doblesPromegaGM2010Luminómetro lector de placas de 96 pocillos

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
  3. Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94(2018).
  4. Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
  5. van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  6. Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
  7. Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
  8. Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
  9. Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715(2011).
  10. Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  12. Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
  13. Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
  14. Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
  15. Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
  16. Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
  17. Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  18. Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
  19. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
  20. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  21. Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  22. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
  23. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
  24. Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061(2018).
  25. Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Ensayo de luciferasaMonitoreo de la actividad quinasaTransfecci n de pl smidosC lulas HEK293Cribado de mol culas peque asWestern blotPCR cuantitativaLumin metro de lectura de placas

Artículos relacionados