Aislamiento de CD4+ las células de T y análisis de circulación folicular T Helper (cTfh) subconjuntos de la célula del uso de sangre periférica citometría de flujo de 6 colores

Resumen

Aquí, un protocolo para el aislamiento y la caracterización de CD4⁺ T-cell se describe subconjuntos de sangre periférica humana. Purificada de CD4⁺ las células T son analizadas por citometría de flujo para determinar proporciones de subconjuntos de células helper T-folicular.

Resumen

Actividad folicular T aberrante de las células helper (Tfh) es detectable en condiciones autoinmunes y su presencia se asocia con resultados clínicos cuando se analiza el microambiente del nodo de linfa en el linfoma no Hodgkin de células B. Subconjuntos de linfocitos T-folicular (cTfh), el compartimiento de memoria circulantes de Tfh células en la sangre en circulación son también perturbados en la enfermedad y por lo tanto representan potenciales nuevos biomarcadores predictivos. Pruebas basadas en sangre periférica es ventajoso porque es relativamente no invasivo y permite el control serial simple. Este artículo describe un método para aislar CD4⁺ las células T de sangre humana y posterior análisis mediante citometría de flujo para enumerar las células cTfh y las proporciones de sus diferentes subconjuntos (cTfhPD-1^{-/ + / hi}, cTfh1, 2, 17 y cTfh1/17). El nivel de estos subconjuntos se comparó entonces entre sujetos normales y pacientes con linfoma. Encontramos que el método era suficientemente robusto como para obtener resultados confiables de material paciente habitualmente recogido. La técnica que describimos para el análisis es adaptable fácilmente a célula clasificación y aplicaciones posteriores como RT-PCR.

Introducción

Linfocitos T folicular (Tfh) son un CD4⁺ subconjunto de células T que fue inicialmente caracterizada en tejidos linfoides¹. Estas células expresan PD-1 y receptores de superficie de CXCR5, secretan IL-21 e IL-4 y expresión nuclear del factor de transcripción, BCL-6^2,3. Como su nombre lo indica, se encuentran en centros germinales y son esenciales para la producción de anticuerpos de alta afinidad¹.

Respuestas de Dysregulated Tfh se han implicado en la patogénesis de la enfermedad, especialmente enfermedades autoinmunes, dond....

Protocolo

Se obtuvieron muestras de sangre de sujetos normales (NS) (n = 12) así como pacientes con linfoma de zona marginal (MZL) (n = 7) y otros tipos de linfoma no Hodgkin de células B (BNHL) (FL 6 pacientes, 2 pacientes de linfoma lymphoplasmacytic y 1 bajo grado de células B no especificado linfoma del no Hodgkin paciente). Se reclutaron pacientes de las clínicas de Hematología en el Royal Infirmary de Leicester después de haber informado, consentimiento por escrito, con la aprobación ética en lugar de todos los estudios. Se obtuvo la aprobación ética de Leicestershire, Northamptonshire y 1 Comité de ética de investigación Rutland, referencia 06/Q2501/122 muestras de pacie....

Resultados

Alta CD4⁺ pureza fue alcanzada usando el CD4⁺ protocolo de aislamiento, que era confiable a través de todas las muestras de sangre probados por nosotros (significa: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (figura 3).

Identificación de cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ células) en un sujeto normal representativo se presenta (figura 4A). La p.......

Discusión

Este protocolo representa una manera simple y eficaz para analizar las células de cTfh de sangre periférica, lo que permite la detección de todos los subconjuntos relevantes identificados en la literatura hasta el momento. Muestras de sangre pueden fácilmente y eficientemente obtenerse como parte de estándar pacientes clínicas y muestras seriales se puede recoger en paralelo con los datos clínicos. A su vez, esto permite estudios prospectivos evaluando la cTfh subconjuntos como biomarcadores de progresión de la enfermeda.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RosetteSep Cóctel de enriquecimiento de células T CD4+	humanas STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Ratón Anti-Humano CD183  Clon 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Ratón Anti-Humano CD196 (CCR6)  Clon 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rata Anti-Humana CXCR5 (CD185)  Clonar  RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Ratón Anti-Humano CD4  Clonar   RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Ratón Anti-Humano CD279  Clon MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Ratón Anti-Humano CD45RA Clon  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas rojas lejanas reparables, para excitación de 633 o 635 nm	ThermoFisher Scientific	L34973
Tampón de manchas brillante	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Juego de partículas de compensación de control negativo	BD CompBead	552843
FACS Aria II Citómetro de flujo	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Citómetro de flujo Software de adquisición
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		software de análisis de datos de citometría de flujo
anticuerpo anti-CXCR3	BD Horizon
Anticuerpo anti-CCR6	BD Horizon
Anticuerpo anti-CXCR5	BD Horizon
Anticuerpo anti-CD4	BD Horizon
Anticuerpo anti-PD-1	BD Pharmingen
Anticuerpo anti-CD45RA	BD Pharmingen
Marcador de viabilidad	ThermoFisher Scientific	L34973

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