Aquí se describe un protocolo para expresar proteínas en protoplastos mediante método de transformación mediada por PEG. El método proporciona fácil expresión de proteínas de interés y eficiente investigación de localización de la proteína y el proceso de importación para las varias condiciones experimentales en vivo.
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Artículo de método
Estudiando la importación de la proteína en cloroplastos con protoplastos
En este artículo
Resumen
Resumen
El cloroplasto es un organelo esencial que es responsable de varios procesos celulares en plantas, tales como la fotosíntesis y la producción de metabolitos secundarios y lípidos. Cloroplastos requieren una gran cantidad de proteínas para estos diversos procesos fisiológicos. Sobre el 95% de las proteínas del cloroplasto son codificadas por el núcleo e importado en cloroplastos desde el citosol después de traducción en los ribosomas citosólicas. Así, la correcta importación o focalización de estas proteínas codificadas por el núcleo cloroplasto cloroplastos es esencial para el buen funcionamiento de los cloroplastos y la célula de la planta. Las proteínas codificadas por el núcleo cloroplasto contienen secuencias de la señal para el objetivo específico a cloroplastos. Maquinaria molecular localizada en el cloroplasto o citosol reconocer estas señales y llevar a cabo el proceso de importación. Para investigar los mecanismos de importación de proteínas o targeting a cloroplastos en vivo, se desarrolló un método rápido y eficiente basado en el protoplasto para analizar proteínas importación en cloroplastos de Arabidopsis. En este método, utilizamos protoplastos aislados de tejidos de la hoja de Arabidopsis. Presentamos un protocolo detallado para que el uso de protoplastos para investigar el mecanismo por el cual las proteínas son importadas en cloroplastos.
Introducción
El cloroplasto es uno de los orgánulos más importantes en las plantas. Una de las principales funciones de los cloroplastos es llevar a cabo fotosíntesis1. Cloroplastos también realizan muchas otras reacciones bioquímicas para la producción de ácidos grasos, aminoácidos, nucleótidos y numerosos metabolitos secundarios1,2. Por todas estas reacciones, cloroplastos requieren un gran número de diferentes tipos de proteínas. Sin embargo, el genoma del cloroplasto contiene sólo aproximadamente 100 genes3,4. Por lo tanto, cloroplastos ....
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Protocolo
1. crecimiento de las plantas de Arabidopsis
- Preparar 1 L Gamborg B5 (B5) medio al añadir 3,2 g de medio de B5 incluyendo vitaminas, 20 g de sacarosa, 0,5 g de 2-(N-morpholino) etano sulfónico ácido (MES) a aproximadamente 800 mL de agua desionizada y ajustar el pH a 5.7 con hidróxido de potasio (KOH). Agregue más desionizada agua llevar el volumen a 1 L. Añadir 8 g de phytoagar y autoclave por 15 min a 121 ° C.
- Permitir que el medio se enfríe a 55 ° C y vierta 20 – 25 mL del medio B5 en una placa Petri (9 cm de diámetro, 1,5 cm de altura) en un banco limpio. Secar las placas durante 2 – 3 días paquete con envoltura limpia y mantenerlos en el refri....
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Resultados
La importación de proteínas en los cloroplastos se puede examinar utilizando dos métodos: microscopía y immunoblot análisis de fluorescencia después de SDS-PAGE-mediado separación. Aquí, utilizamos gr-nt:GFP, una fusión construir la codificación de los residuos del aminoácido N-terminal 79 de glóbulos rojos que contiene el péptido de tránsito fusionado a GFP. Cuando las proteínas son importadas en cloroplastos, las señales de fluorescencia verde de la proteína diana gr-nt:GFP deben combin.......
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Discusión
Proporcionamos un protocolo detallado para el uso de protoplastos de Arabidopsis para estudiar proteínas importación en cloroplastos. Este método es de gran alcance para investigar el proceso de importación de proteínas. Esta técnica simple y versátil es útil para examinar la focalización de las proteínas de carga previsto a cloroplastos. Usando este método, protoplastos están preparados de tejidos de hojas de Arabidopsis11,12 que puede obteners.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo se llevó a cabo con los apoyos del programa de investigación cooperativo para la agricultura ciencia y tecnología de desarrollo (proyecto no. PJ010953012018), administración de Desarrollo Rural y la beca de la Fundación Nacional de investigación (Corea) financiado por el Ministerio de ciencia y las TIC (Nº 2016R1E1A1A02922014), República de Corea.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| GAMBORG B5 MEDIO QUE INCLUYE VITAMINAS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SACAROSA | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHIDRATO | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, polvo | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Cinta quirúrgica | 3M | 1530-0 | |
| Cuchilla quirúrgica inoxidable No.10 | FEATHER | No disponible | |
| Tubo cónico, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | disponible | |
| ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | No disponible | |
| ALBÚMINA BOVINA (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Manitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CLORURO DE CALCIO, DIHIDRATADO | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Vaso de pantalla para CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Pantallas para CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Placa de Petri | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pipeta Pasteur | HILGENBERG | 3150102 | |
| CENTRÍFUGA DE LABORATORIO / DE SOBREMESA | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Cloruro de sodio | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Cloruro de potasio | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSA, ANHIDRA | BIO BASIC | GB0219 | |
| Hidróxido de potasio | DUKSAN | 40 | |
| Nitrato de calcio tetrahidratado | SIGMA | C2786-500G | |
| Poli(etilenglicol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | SIGMA | M2393-500G | |
| Tubo 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Portaobjetos de microscopio | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscopio Cubreobjetos | MARIENFELD | 101030 | |
| Cámara de recuento | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Microscopio de imagen | Carl Zeiss | No disponible | |
| Microtubo 1,5 ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2- Mercaptoetanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Dodecil Sulfato de Sodio (SDS), Grado Proteómico | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Grado Ultra Puro | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Ditiothreitol), Grado Biotecnológico | VWR | 0281-25G | |
| Sal sal sódica azul de bromofenol ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glicerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.V. Anticuerpo monoclonal (JL-8) | TAKARA | 632381 |
Referencias
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al.
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Etiquetas
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