En Vivo Proyección de imagen de especies reactivas de oxígeno en un murino herida modelo

Resumen

Describimos una invasiva en vivo imagen protocolo que es sencilla y económica, utilizando L-012, un análogo de quimioluminiscente luminol, para visualizar y cuantificar las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas en un modelo de ratón por escisión de la herida.

Resumen

La generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) es un rasgo distintivo de los procesos inflamatorios, pero en exceso, el estrés oxidativo está ampliamente implicado en diversas patologías como cáncer, aterosclerosis y diabetes. Previamente hemos demostrado que la disfunción del factor Nuclear (derivados del eritroide 2)-como 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como célula proteína derivada Keap 11señalización vía conduce al desequilibrio extremo de ROS durante cutáneo cicatrización en la diabetes. Puesto que los niveles ROS son un importante indicador de la progresión de la cicatrización de heridas, técnicas de cuantificación específicas y precisas son valiosas. Diversos estudios en vitro para medir ROS en las células y los tejidos han sido descritas; sin embargo, sólo proporcionan una medición acumulativa individual por muestra. Más recientemente, han permitido el desarrollo de indicadores basados en la proteína y de modalidades de imágenes únicos análisis espaciotemporal. L-012 (C₁₃H₈ClN₄NaO₂) es un derivado luminol que puede utilizar para tanto en vivo como en vitro quimioluminiscente detección de ROS generados por la oxidasa NAPDH. L-012 emite una señal más fuerte que otras sondas fluorescentes y se ha demostrado para ser sensible y confiable para la detección de ROS. La aplicabilidad de lapso de tiempo de L-012-facilitó la proyección de imagen proporciona información valiosa sobre los procesos inflamatorios mientras reduce la necesidad de sacrificio y en general reduciendo el número de animales de estudio. Aquí, describimos un protocolo utilizando L-012-facilitado en vivo la proyección de imagen para cuantificar el estrés oxidativo en un modelo de cicatrización de la herida excisional con ratones diabéticos de Nrf2/Keap1 localmente disfuncional.

Introducción

Metabolitos de oxígeno generados por procesos inflamatorios contribuyen a varias cascadas de señales así como alteraciones destructivas de componentes celulares¹. Utilización de técnicas sensibles y específicas para medir ROS es crítica para el estudio de procesos inflamatorios y caracterización de los efectos del estrés oxidativo. Proyección de imagen in vivo es valioso debido a su capacidad para proporcionar datos dinámicos espaciales y temporales en tejido vivo. L-012 es una sintético sonda quimioluminiscente que es altamente sensible para los aniones superóxido y produce una mayor intensidad de luz que otras sondas fluorescentes en....

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de la New York University School of Medicine. Todos los ratones se encuentran detrás de una barrera y todo el personal use equipo de protección personal.

1. día 0: Preparación de un modelo murino de cicatrización de la herida Excisional

1. Anestesiar ratones diabéticos de (Lepr^db/db), de 8 – 12 semanas, con inhalatorios isoflurano 2%. Confirmar que cada ratón ha sido adecuadamente anestesiado mediante la prueba de pie almohadilla pizca. Aplicar lubricante ocular estéril para cada ojo para evitar la irritación por seque....

Resultados

Tres días después de crear heridas bilaterales según un modelo establecido herida excisional (figura 1A), ratones diabéticos se colocan en la cámara de proyección de imagen. Una fotografía inicial y una medida de la bioluminiscencia se toman antes de la inyección de L-012 para tener en cuenta para la señal de fondo (figura 1B). Después de la inyección intraperitoneal con la solución de L-012, los ratones se reposicionó en la cáma.......

Discusión

Técnicas comunes para la medición de ROS han sido limitadas por protocolos complejos que requieren la extracción de tejido o técnicas invasivas. En los últimos años, se han reportado mediciones del estrés oxidativo sobre la base de modalidades de imágenes innovadoras, permitiendo evaluaciones spatiotemporal^9,10,11. L-012 tiene varias ventajas como sonda quimioluminiscente luminol, lucigenina y MCLA^1,.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bks. Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J ratones	Jackson Laboratories 000642
13 cm x 18 cm Lámina de silicona (0,6 mm)	Sigma Aldrich
3M Tegaderm Apósitos de película transparente	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección	Life Technologies
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silenciador control negativo	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Suero reducido	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Metil-celulosa	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR Sistema de imágenes in vivo	PerkinElmer

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