Espectroscopia de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es un método inequívoco para medir a los radicales libres. El uso de puntas de prueba de giro selectivo permite la detección de radicales libres en diferentes compartimentos celulares. Se presenta un método práctico y eficiente para recolectar muestras biológicas que facilitan el tratamiento, almacenamiento y transferencia de muestras para mediciones de EPR.
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Artículo de método
Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K
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Resumen
Resumen
La detección precisa y específica de especies reactivas del oxígeno (ROS) en diferentes compartimentos celulares y tejido es esencial para el estudio de la regulación de redox señalización en configuración biológica. Espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) es el método directo sólo para evaluar inequívocamente los radicales libres. Su ventaja es que detecta los niveles fisiológicos de especies específicas con una alta especificidad, pero que requiere de tecnología especializada, preparación de la muestra cuidado y controles adecuados para asegurar la correcta interpretación de los datos. Sondas de vuelta cíclica hidroxilamina reaccionan selectivamente con superóxido u otros radicales para generar una señal de nitróxido que puede cuantificarse por espectroscopia de EPR. Permeable a la célula spin sondas y puntas de prueba de giro diseñados para acumular rápidamente en la mitocondria permiten la determinación de la concentración de superóxido en diferentes compartimentos celulares.
En cultivos de células, el uso de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine permeable de la célula (CMH) a lo largo de con y sin pretratamiento de células impermeables de la superóxido dismutasa (SOD) o uso de PEG-SOD permeable a la célula, permite el diferenciación de extracelular de citosólica superóxido. La 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondrial] piperidinium dicloruro (mito-TEMPO-H) permite la medición de ROS mitocondriales (predominante superóxido).
Puntas de prueba de giro y espectroscopia del EPR pueden aplicarse también a los modelos en vivo . Superóxido puede detectarse en los fluidos extracelulares como la sangre y el líquido alveolar, así como los tejidos como el tejido pulmonar. Se presentan varios métodos para procesar y almacenar el tejido para las mediciones del APE y entregar 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine intravenosa (CPH) spin sonda en vivo. Mientras que las mediciones pueden realizarse a temperatura ambiente, muestras obtenidas de modelos in vitro e in vivo también pueden ser almacenadas a-80 ° C y analizadas por EPR en 77 K. Las muestras pueden almacenarse en el establo de tubería especializada a-80 ° C y corren de 77 K para permitir un práctico, eficiente y el método reproducible que facilita el almacenamiento y transferencia de muestras.
Introducción
Mientras que las medidas de estrés oxidativo y especies reactivas del oxígeno son importantes para el estudio de diversas enfermedades a través de todos los sistemas del órgano, la detección de especies de oxígeno reactivo (ROS) es un reto debido a la corta vida media y alta reactividad. Una técnica de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es el método más claro para la detección de radicales libres. Puntas de prueba de giro tienen ventajas sobre las sondas fluorescentes más comúnmente utilizadas. Aunque sondas fluorescentes son relativamente baratas y fáciles de usar y proporcionar una detección rápida, sensible de ROS, tienen serias limitaciones debido a señal....
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Protocolo
Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Colorado Denver Animal cuidado institucional y Comité de uso.
1. preparación de reactivos
-
Stock de Diethylenetriaminepentaacetic ácido (DTPA) (150 mM)
- Añadir 2,95 g de DTPA (393.35 g/mol) a 10 mL de agua desionizada.
- Para disolver el DTPA, añadir 1 M NaOH gota a gota y a un pH de 7.0.
- Llevar el volumen a 50 mL con agua a una concentración final de DTPA de 150 mM y almacenar a 4 ° C.
-
Solución salina buffer fosfato (PBS) (50 mM, pH 7.4)
- Preparar 5 M de cloruro de s....
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Resultados
Detección de superóxido con CMH fue validada utilizando la X / superóxido XO genera el sistema para demostrar que la señal nitróxido (CM.) fue completamente inhibida por césped, mientras que la catalasa no tuvo ningún efecto (figura 1A). El superóxido extracelular, total luego fue evaluado en células RAW 264.7 células de incubación con la sonda de spin CMH permeable a la célula +-pretratamiento de SOD. Se midió la concentración de nitróxido en la s.......
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Discusión
La evaluación de la producción de radicales libres en entornos biológicos es importante en redox entendimiento reglamentado en salud y la enfermedad, pero la medida de estas especies es muy difícil debido a la corta vida media de las especies de radicales libres y técnicas limitaciones de los métodos comúnmente utilizados. EPR es una herramienta valiosa y poderosa en biología redox, ya que es el método sólo inequívoco para detectar radicales libres. En este proyecto demostramos métodos prácticos de EPR para diseñar exper.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Universidad de Colorado escuela de medicina Decano concesión de infraestructura de investigación estratégica, R01 HL086680-09 y 1R35HL139726-01, al Premio de beca E.N.G. y UCD CFReT (él). Los autores agradecen a Dr. Sandra Eaton y el Dr. Gareth Eaton (Universidad de Denver), Dr. Gerald Rosen y Dr. Joseph P. Kao (Universidad de Maryland) y Dr. Sujatha Venkataraman (Universidad de Colorado Denver) para discusiones útiles y Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie y Ivy McDermott (Universidad de Colorado Denver) para el soporte técnico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | medios de cultivo celular |
| Dietilentriaminoácido pentaacético (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| cloruro de sodio (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | utilizado para preparar 50 mM de tampón salino de fosfato según Sigma aldrish |
| fosfato de potasio dibásico (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | utilizado para preparar 50 mM de tampón salino de fosfato según Sigma aldrish |
| fosfato de potasio monobásico (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | utilizado para preparar 50 mM de tampón salino de fosfato según Sigma aldrish |
| Tampón Krebs-Henseleit (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Superóxido dismutasa de eritrocitos bovinos (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Disolver en DMSO |
| Antimicina A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Disolver en etanol y almacenar en viales de vidrio (MW utilizado es el peso molecular promedio para cuatro lotes) |
| 1-Hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina . HCl (CMH) | Enzo Ciencias de la Vida | ALX-430-117-M050 | |
| 1-hidroxi-3-carboxi-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina . HCl (CPH) | Enzo Ciencias de la Vida | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hidroxi-4-[2-trifenilfosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1-Hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-4-[2-(trifenilfosfonio)acetamido]dicloruro de piperidinio ( mito-TEMPO-H) | Enzo Ciencias de la Vida | ALX-430-171-M005 | |
| Cloruro de 1-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-4-il-trimetilamonio . HCl (CAT1H) | Enzo Ciencias de la Vida | ALX-430-131-M250 | |
| Heparina | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Cloruro de difeniliodonio | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Sal de mesilato de deferoxamina | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| MARCA desechable BLAUBRAND micropipetas, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | capilares |
| TUBO FRACCIONADO DE FLUOROPOLÍMERO DE PTFE 3/16" Diámetro exterior x 1/8" ID | NORELL | 1598774A | Tubo de teflón |
| TAPONES DE CAUCHO DE SILICONA PARA TUBOS DE MUESTRA DE RMN PARA TUBOS DE PARED DELGADA CON UN DIÁMETRO EXTERIOR DE 4 mm-5 mm (3,2 mm A 4,2 mm DE DIÁMETRO INTERIOR) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Espectrómetro EPR de sobremesa | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| CÉLULA DE TEJIDO NANO EMX | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
Referencias
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al.
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Reimpresiones y permisos
