Artículo de método

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

DOI:

10.3791/58461

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11 de enero de 2019

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1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratories and Pediatric Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Bruker BioSpin Corp, 3Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center

En este artículo

Resumen

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Espectroscopia de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es un método inequívoco para medir a los radicales libres. El uso de puntas de prueba de giro selectivo permite la detección de radicales libres en diferentes compartimentos celulares. Se presenta un método práctico y eficiente para recolectar muestras biológicas que facilitan el tratamiento, almacenamiento y transferencia de muestras para mediciones de EPR.

Resumen

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La detección precisa y específica de especies reactivas del oxígeno (ROS) en diferentes compartimentos celulares y tejido es esencial para el estudio de la regulación de redox señalización en configuración biológica. Espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) es el método directo sólo para evaluar inequívocamente los radicales libres. Su ventaja es que detecta los niveles fisiológicos de especies específicas con una alta especificidad, pero que requiere de tecnología especializada, preparación de la muestra cuidado y controles adecuados para asegurar la correcta interpretación de los datos. Sondas de vuelta cíclica hidroxilamina reaccionan selectivamente con superóxido u otros radicales para generar una señal de nitróxido que puede cuantificarse por espectroscopia de EPR. Permeable a la célula spin sondas y puntas de prueba de giro diseñados para acumular rápidamente en la mitocondria permiten la determinación de la concentración de superóxido en diferentes compartimentos celulares.

En cultivos de células, el uso de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine permeable de la célula (CMH) a lo largo de con y sin pretratamiento de células impermeables de la superóxido dismutasa (SOD) o uso de PEG-SOD permeable a la célula, permite el diferenciación de extracelular de citosólica superóxido. La 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondrial] piperidinium dicloruro (mito-TEMPO-H) permite la medición de ROS mitocondriales (predominante superóxido).

Puntas de prueba de giro y espectroscopia del EPR pueden aplicarse también a los modelos en vivo . Superóxido puede detectarse en los fluidos extracelulares como la sangre y el líquido alveolar, así como los tejidos como el tejido pulmonar. Se presentan varios métodos para procesar y almacenar el tejido para las mediciones del APE y entregar 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine intravenosa (CPH) spin sonda en vivo. Mientras que las mediciones pueden realizarse a temperatura ambiente, muestras obtenidas de modelos in vitro e in vivo también pueden ser almacenadas a-80 ° C y analizadas por EPR en 77 K. Las muestras pueden almacenarse en el establo de tubería especializada a-80 ° C y corren de 77 K para permitir un práctico, eficiente y el método reproducible que facilita el almacenamiento y transferencia de muestras.

Introducción

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Mientras que las medidas de estrés oxidativo y especies reactivas del oxígeno son importantes para el estudio de diversas enfermedades a través de todos los sistemas del órgano, la detección de especies de oxígeno reactivo (ROS) es un reto debido a la corta vida media y alta reactividad. Una técnica de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es el método más claro para la detección de radicales libres. Puntas de prueba de giro tienen ventajas sobre las sondas fluorescentes más comúnmente utilizadas. Aunque sondas fluorescentes son relativamente baratas y fáciles de usar y proporcionar una detección rápida, sensible de ROS, tienen serias limitaciones debido a señales artifactual, la incapacidad para calcular concentraciones de ROS y una falta general de especificidad1 .

Para facilitar el uso de EPR para estudios biológicos, una variedad de sondas se han sintetizado de la vuelta que puede medir una gama de especies de radicales libres biológicamente relevantes como pO2, pH y redox indica2,3, 4,5,6,7. Las trampas de la vuelta también se han desarrollado para capturar a los radicales de breve duración y larga vida forma aductos, que facilita la detección por APE8. Ambas clases (sondas de spin y spin trampas) tienen ventajas y limitaciones. Una clase comúnmente usada de puntas de prueba de giro son hydroxylamines cíclicas, EPR-silencioso y reaccionan con los radicales de breve duración para formar un nitróxido estable. Hydroxylamines cíclicos reaccionan con el superóxido 100 veces más rápido que las trampas de la vuelta, permitiéndoles competir con antioxidantes celulares, pero carecen de especificidad y requiere el uso de controles apropiados y los inhibidores para identificar la especie radical o fuente responsable de la señal de nitróxido. Mientras que spin trampas exhiben especificidad, con distintas espectral patrones dependiendo de la especie atrapada, tienen cinética lenta para superóxido spin reventado y son susceptibles a la biodegradación de la radical aductos. Aplicaciones para la captura de vuelta han sido bien documentados en la investigación biomédica9,10,11,12,13.

El objetivo de este proyecto es demostrar métodos prácticos de EPR para el diseño de experimentos y preparación de muestras para detectar superóxido usando puntas de prueba en diferentes compartimentos celulares in vitro y en compartimientos de tejido diferente en vivo. Varios manuscritos han publicado protocolos pertinentes a estos objetivos, usando puntas de prueba de giro objetivo permeable a la célula, célula impermeable y mitocondrial al tejido distintos compartimentos celulares in vitro y proceso para el análisis en modelos de ratón 14 , 15. construir sobre este cuerpo de literatura mediante la validación de un método para medir superóxido usando una sonda de spin 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) en diferentes compartimentos celulares en vitro para asegurar precisa medidas, destacando posibles problemas técnicos que pueden sesgar los resultados. También ofrecemos métodos para realizar mediciones de APE en sangre, lavado broncoalveolar y tejido pulmonar utilizando la punta de prueba de giro CMH. Estos estudios comparan diferentes métodos para procesar los tejidos, así como presentar un método para inyectar otra sonda de spin, CPH, en ratones antes de la cosecha de tejido. Finalmente, desarrollamos un método práctico para almacenar las muestras en tubos de politetrafluoretileno (PTFE) para permitir el almacenamiento y transferencia de muestras antes de las mediciones de EPR a 77 K.

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Protocolo

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Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Colorado Denver Animal cuidado institucional y Comité de uso.

1. preparación de reactivos

  1. Stock de Diethylenetriaminepentaacetic ácido (DTPA) (150 mM)
    1. Añadir 2,95 g de DTPA (393.35 g/mol) a 10 mL de agua desionizada.
    2. Para disolver el DTPA, añadir 1 M NaOH gota a gota y a un pH de 7.0.
    3. Llevar el volumen a 50 mL con agua a una concentración final de DTPA de 150 mM y almacenar a 4 ° C.
  2. Solución salina buffer fosfato (PBS) (50 mM, pH 7.4)
    1. Preparar 5 M de cloruro de sodio (NaCl) (58.44 g/mol; 29,22 g/100 mL).
    2. Preparar 1 M de potasio Fosfato dibásico HK2PO4 (174.18 g/mol; 17,42 g/100 mL)
    3. Preparar 1 M de potasio fosfato monobásico KH2PO4 (136,1 g/mol; 13,61 g/100 mL). Mezclar 3 mL de 5 M NaCl con 4,24 de 1 M de fosfato de potasio dibásico y 0,760 mL de potasio de 1 M fosfato monobásico. Compruebe el pH.
    4. Llevar el volumen a 100 mL con agua desionizada.
    5. Almacenar a temperatura ambiente (RT) para a corto plazo (días) y a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo (semanas).
  3. Tampón de Krebs-Henseleit (KHB) que contiene 100 μm DTPA
    1. En tubo de centrífuga cónico de 50 mL, añadir 33,3 μl de solución stock de 150 m m DTPA.
    2. Llevar a un volumen de 50 mL con tampón Krebs-Henseleit (KHB).
    3. Preparación buffer fresca con DTPA cada día y mantener a TA.
  4. Tampón Tris-EDTA que contiene sacarosa
    1. Preparar acciones de Tris de 0,5 M: disolver 15,14 g de Tris base (121.14 g/mol) en 150 mL de agua desionizada. Con ácido clorhídrico, ajustar el pH a 7.8 y llevar a un volumen final de 250 mL.
    2. Disolver 21,4 g de sacarosa (g/mol 342.29; concentración final = 0.25 mM) en 150 mL de agua desionizada.
    3. Añadir 5 mL de Tris acción a sacarosa para lograr una concentración final de Tris 10 mM.
    4. Añada 0,5 mL de caldo de EDTA de 0.5 M de Tris sacarosa para lograr una concentración final de 1 mM.
    5. Compruebe el pH y ajústelo a 7,4.
    6. Llevar a un volumen final de 250 mL con agua desionizada y almacenar a 4 ° C.
  5. Eritrocito bovino stock de Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD) (30.000 U/mL)
    1. Reconstituir 30.000 U de SOD en 1 mL de PBS (aproximadamente 5,7 mg, dependiendo de la actividad de gran cantidad SOD).
    2. Mezcla bien, alícuota y almacenar a-20 ° C a corto plazo (6-12 meses) y a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
  6. Solución de trabajo de SOD (1000 U/mL)
    1. Transferir una alícuota de 30 μl de 30.000 acciones de césped U/mL en un 870 μl de PBS estéril.
    2. Mantener la solución en el hielo y usar fresco.
  7. Stock de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (5 mM)
    1. Disolver 1 mg de PMA (616.83 g/mol) en 325 μl de DMSO (concentración final = 5 mM).
    2. Parte alícuota de una solución de 5 mM PMA y almacenar a-20 ° C.
  8. Solución de trabajo PMA (125 μm)
    1. Diluir una alícuota de 10 μl del stock PMA de 5 mM en 390 μl de PBS estéril.
    2. Mantener la solución en el hielo y usar fresco.
    3. Para un control de vehículos de PMA, utilice 10 μl de DMSO en 390 μl de PBS.
  9. Cloruro de Diphenyliodonium (DIP) (2,5 mM)
    1. Disolver 3,2 mg de inmersión (316.57 g/mol) en 4 mL para obtener un stock de 2, 5 mM.
    2. Preparar la solución y utilizarla fresca.
  10. Sal de mesilato de deferoxamina (DFO) (20 mM)
    1. Disolver 4,5 mg de DFO (656,79 g / mol) en 340 μL para obtener un stock de 20 mM.
    2. Preparar la solución y utilizarla fresca.
  11. Preparación de antimicina stock A (AA) (5 mM)
    1. Disolver 5,4 mg de AA (532 g/mol) en 2 mL de etanol (concentración final = 5 mM).
    2. Alícuota del material en frascos de cristal y almacenar a-20 ° C.
  12. Preparación de puntas de prueba de giro
    1. La burbuja 50 mM fosfato buffer que contiene 100 μm DTPA con nitrógeno durante 30 min para eliminar el oxígeno disuelto de la solución tampón.
    2. Retire la sonda de spin del congelador de-20 ° C y deje el recipiente a RT (10-15 min).
    3. Pesar 2,4 mg de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· Ácido clorhídrico (CMH) (237.8 g/mol)
    4. CMH se disuelven en 1 mL del buffer fosfato sin oxígeno para una concentración final de 10 mM.
    5. Pesar 5 mg de dicloruro de 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium (mito-TEMPO-H) (529.1 g/mol).
    6. Mito-TEMPO-H se disuelven en 1 mL del buffer fosfato desoxigenada hasta una concentración final de 9,5 mM.
    7. Pesar 4,9 mg de 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· Ácido clorhídrico (CPH) (223.7 g/mol).
    8. CPH se disuelven en 1 mL del buffer fosfato sin oxígeno para una concentración final de 22 mM.
    9. Alícuota y conservar a-80 ° C (congelación y descongelación no se recomienda).

2. detección de superóxido en vitro

  1. Detección de superóxido intracelular, extracelular y total en estimulada por PMA RAW 264.7 células en RT
    1. Siguiendo una técnica aséptica adecuada, descongelar las células RAW 264.7 y paso en medio DMEM suplementado con 10% FBS (libre de endotoxinas bajo) y 1% antimicótico/ampicilina a 37 ° C en incubadora de CO2 .
    2. Las células RAW 264.7 de semilla en 1 x 106 células/pozo en placas de 6 pocillos un día antes del tratamiento.
    3. Suavemente Retire media y lavar las células una vez con 1 mL de tampón KHB.
    4. Añadir KHB conteniendo 100 μm DTPA a cada pocillo y tratar en un volumen total de 500 μl con los siguientes:
    5. Para pocillos pretratados con el césped, añadir 15 μL/pocillo de solución de trabajo de SOD (1000 U/mL, concentración final de SOD = 30 U/mL) e incubar 10 min a 37 ° C antes de la adición de CMH y PMA.
    6. Añadir 12.5 μL/pocillo de la acción CMH de 10 mM (concentración final = 0.25 mM).
    7. Agregar 40 μL/pocillo de solución de trabajo de PMA de 125 μm (concentración final = 10 μm) o 40 μl (stock 10 μl de DMSO en 390 μl de PBS).
    8. Incubar durante 50 min a 37 ° C en un incubador de CO2 .
    9. Retire las placas de la incubadora y coloque inmediatamente en hielo.
    10. Recoger el buffer de cada pozo en separado, 1.5 mL, etiquetado tubos. Mantener el hielo a lo largo.
    11. Añadir 100 μl de buffer KHB fresco que contiene 100 μm DTPA, suavemente raspar las células y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo varias veces. Mantener el hielo a lo largo de resuspensión de células.
    12. Carga la muestra recogida en los pasos 2.1.10 y 2.1.11 (50 μL) en cada uno de los tubos capilares. Selle ambos extremos y ejecute el EPR.
      Nota: Siempre probar un tubo o bien (sin células) que contiene la sonda en solución tampón (misma concentración = 0.25 mM), tratada bajo las mismas condiciones que las células (mismo tiempo de incubación y temperatura) como control, ya que es la intensidad de fondo de la sonda de temperatura - y dependiente del tiempo.
    13. Establecer los parámetros de adquisición de EPR a lo siguiente: frecuencia de microondas = 9,65 GHz; campo de centro = 3432 G; amplitud de modulación = 2.0 G; anchura de barrido = 80 G; potencia de microondas = 19,9 mW; número total de exploraciones = 10; tiempo de barrido = 12.11 s; y constante de tiempo = 20,48 ms.
  2. Detección de superóxido mitocondrial en células RAW 264.7
    1. Siga los pasos 2.1.1 y 2.1.2 células RAW 264.7 de semilla un día antes del experimento.
    2. Los medios de quitar y lavar las células una vez con 1 mL de tampón KHB.
    3. Añadir 200 μL de KHB conteniendo 100 μm DTPA a cada pocillo.
    4. Añadir 5.3 μL/pocillo de stock de mito-TEMPO-H 9.5m m (concentración final = 0.25 mM)
    5. Incubar por 10 min a TA.
    6. Añadir 1 μL/pocillo de antimicina A (AA), solución madre 5 mM en etanol (concentración final = 25 μm).
    7. Incubar durante 50 min a 37 ° C en un incubador de CO2 .
    8. Retire las placas de la incubadora y coloque inmediatamente en hielo.
    9. Suavemente raspar las células y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo. Mantener en hielo.
    10. Cargar la muestra en un tubo capilar. Selle ambos extremos.
    11. Consulte la sección anterior para el valor de APE.
  3. Detección de superóxido en las células RAW 264.7 en 77 K
    1. Colocar el tampón recogido en el paso 1.1.10 preparado PTFE tubo 1-2 pulgadas de largo (3/16" OD x 1/8" ID). Asegúrese de que la tubería de PTFE es recta por lo que puede ser fácilmente insertado y removido del dedo dewar. Use un tapón de caucho para cerrar un extremo de la tubería de PTFE, pipetear el tampón o la suspensión de la célula (100 a 150 μL) en el tubo de PTFE y sellar el tubo con un tapón de segunda.
    2. Flash congelar la muestra en nitrógeno líquido. La muestra se transfirió a un tubo etiquetado criopreservación para almacenamiento a-80 ° C o ejecutar inmediatamente.
    3. Llenar el dedo dewar con nitrógeno líquido y coloque la tubería de PTFE que contiene la muestra en el dedo dewar. Asegúrese de que la muestra está centrada en el espacio activo del resonador y ejecutar EPR a 77 K.
      Nota: Iniciar el flujo de gas nitrógeno a su espectrómetro de 15-30 min antes de las mediciones y continuar este flujo a lo largo de las medidas para evitar la condensación de agua en el resonador.
    4. Definir los parámetros de adquisición de EPR a lo siguiente: frecuencia de microondas = 9,65 GHz; campo de centro = 3438 G; amplitud de modulación = 4,0 G; anchura de barrido = 150 G; potencia de microondas = 0.316 mW; número total de exploraciones = 10; tiempo de barrido = 60 s; y constante de tiempo = 1,28 ms.

3. EPR mediciones en líquidos

  1. Sangre entera
    1. Tratamiento de ratones (8-12 semanas) con una sola dosis de bleomicina intratraqueal (Bleo; 100 μL en 1 U/mL) disuelta en PBS o PBS solo como se describió anteriormente16,17.
    2. Eutanasia a ratones mediante la administración de isoflurano inhalado (1.5-4%) seguido de exsanguinación y la dislocación cervical. Aspirar sangre a través del ventrículo derecho en una jeringa con heparina (1000 USP/mL) conteniendo 100 μm DTPA y transfiéralo a un tubo de 1,5 mL.
    3. En un tubo separado 1,5 mL, añadir 15 μl de PBS con DTPA de 100 μm y 3 μl de CMH (10 mM) a 132 μl de sangre para un volumen total de 150 μL y concentración final de CMH de 0,2 mM.
    4. Incubar sangre 10 min a 37 ° C en un baño de agua.
    5. Retirar los tubos del baño de agua.
    6. Tomar una alícuota por la carga de sangre en un tubo capilar y corren EPR RT con los siguientes parámetros de adquisición de EPR: frecuencia de microondas = 9,65 GHz; campo de centro = 3432 G; amplitud de modulación = 1,0 G; anchura de barrido = 80 G; potencia de microondas = 19,9 mW; número total de exploraciones = 3; tiempo de barrido = 12.11 s; y constante de tiempo = 20.48 Sra. alternativamente, las muestras pueden ser flash congelado como se describe en el paso 2.3 para las mediciones de parámetros de adquisición de 77 K. EPR son los siguientes: frecuencia de microondas = 9,65 GHz; campo de centro = 3438 G; amplitud de modulación = 4,0 G; anchura de barrido = 150 G; potencia de microondas = 0.316 mW; número total de análisis = 2; tiempo de barrido = 60 s; y constante de tiempo = 1,28 ms.
  2. Lavado broncoalveolar (BALF)
    1. Después de la eutanasia (ver paso 3.1.2), recoger BALF por infundir lentamente y retirar 1 mL de PBS con 100 μm DTPA tres veces en una jeringa a través de una cánula colocada en la tráquea.
    2. En un tubo de 1,5 mL, tratar 200 μL de BALF con 4 μL de CMH (10 mM) para obtener una concentración final de 0,2 mM.
    3. Incubar BALF durante 50 min a 37 ° C en un baño de agua.
    4. Tome los tubos en el baño de agua y coloque en hielo.
    5. Carga BALF en un tubo capilar y EPR funcionamiento a temperatura ambiente con la misma configuración de EPR en paso 1.1.13 o flash congelar en nitrógeno líquido como se describe en el paso 2.3.
  3. Medición de APE en sangre BALF en 77 K
    1. Seguir el protocolo para recoger la sangre (pasos 3.1.1. a 3.1.4) y BALF (pasos 3.2.1 a 3.2.4).
    2. Lugar 150 μL de sangre tratada o BALF en PTFE (1-2 in) de la tubería. Use un tapón de caucho para cerrar un extremo de la tubería de PTFE antes de añadir la muestra y otro tapón para sellar el tubo.
    3. Flash congelar la muestra en nitrógeno líquido.
    4. Ver punto 2.3 para detalles sobre la ejecución de EPR en muestras congeladas en tubería de PTFE con el dedo que Dewar en 77 K. funcionamiento congelados CMH había tratado muestras de sangre con en una semana.

4. EPR medidas en tejido pulmonar

  1. Flash tejido pulmonar congelados
    1. Después de recoger el BALF en paso 3.2.1, se abre el pecho y pulmones enjuagarse con 10 mL de PBS frío a través del ventrículo derecho para quitar la sangre. Flash congelar el tejido pulmonar en nitrógeno líquido. Tejido pulmonar congelados puede almacenarse a-80 ° C hasta 6 meses hasta su uso para la medición de APE.
    2. Estabilizar el tejido pulmonar en hielo seco con unas pinzas y corte varios trozos pequeños (5-15 mg) de tejido pulmonar con un solo filo.
    3. Pese el tejido en un tubo de 1,5 mL, coloque el tubo en la balanza y Tarar la balanza, entonces añadir las piezas de tejido y registrar el peso.
    4. A los tejidos en el tubo de 1,5 mL, añadir 196 μl de KHB conteniendo DTPA y 4 μL de CMH (0,2 mM) para lograr un volumen total de 200 μl.
    5. Incubar durante 1 h a 37 ° C en un baño de agua.
    6. Desactivación (durante unos segundos) en una microcentrífuga a 3.884 x g.
    7. Coloque en hielo y Pipetear 150 μL del sobrenadante en el tubo de PTFE y congele para las mediciones de 77 K, como se describe en la sección 2.3.
      Nota: Para este método, debe considerarse la heterogeneidad de la lesión. Por una lesión pulmonar inducida por bleomicina, dado que es una lesión altamente heterogénea, se recomienda cortar varias piezas de tejido de diferentes partes del pulmón de cada ratón. Alternativamente, un pedazo más grande de tejido puede ser homogeneizado en tampón KHB que contiene 100 μm DTPA con una relación peso a volumen de 1:6 (mg/μL) como se describe a continuación.
  2. Tejido pulmonar fresco conservado en tampón de sacarosa
    1. Limpie los pulmones lavaged con PBS frío para extraer sangre como hecho en el paso 3.1.2.
    2. Homogeneizar el tejido pulmonar fresco en tampón Tris-EDTA que contiene sacarosa de 0,25 M con una relación de 1:6 pulmón tampón (mg/μL) Dounce tejido molinillo con un vaso o mortero PTFE.
    3. Añadir 50 μl del homogeneizado de pulmón a 450 μl de KHB conteniendo 100 μm DTPA.
    4. En un tubo de 1.5 mL (en un volumen total de 100 μL), a 98 μl de homogenado de pulmón en KHB, añadir 2 μl de CMH de stock de 10 mM para obtener una concentración final de 0,2 mM.
    5. Incubar por 20 min 37 ° C en un baño de agua.
    6. Coloque las muestras en hielo y cargarlos en un tubo capilar. Ejecute el EPR en RT (ajustes de utilizado en paso 2.1.13).
    7. Para comprobar la contribución de fuentes utilizando diferentes inhibidores y especie específica, tratamiento previo 88 μl de homogenado de pulmón +-inhibidor, ajustar con KHB para alcanzar un volumen final de 98 μl. En este experimento, los inhibidores incluyen 10 μl de SOD (100 U/mL), 4 μL de deferoxamina (DFO; concentración final = 800 μm), o 4 μL de cloruro de diphenyliodonium (DIP; concentración final = 100 μm). Incubar por 20 min a 37 ° C en un baño de agua.
    8. Añadir 2 μl de CMH e incubar durante otros 20 minutos a 37 ° C, seguido por medidas de EPR como se describió anteriormente. Incluyen una única muestra en blanco emparejada con CMH KHB con tampón de sacarosa. Como alternativa, guardar alícuotas de los homogenados de pulmón restante (paso 3.1.2) a-80 ° C para futuras mediciones.
      Nota: El volumen total puede adaptarse según sea necesario.
  3. Mediciones de EPR en tejido pulmonar de los ratones inyectados con spin sondas en vivo (a temperatura ambiente utilizando células de tejido)
    1. Preparar solución stock CPH disolviendo 4,9 mg de CPH en 1 mL de filtrado y desoxigenada 50 mM de tampón fosfato.
    2. Anestesiar ratones con isoflurano inhalado (1.5-4%) durante 20-30 segundos hasta que no responde al dedo del pie sujetador. Inyectar 100 μl de la sonda de spin CPH para un peso de 25 g ratón ruta de ratones vía retroorbital (dosis final = 20 mg/kg) y permitir que la sonda se circule durante 1 h. inmediatamente después de la inyección de retroorbital, añadir una gota de 0.5% proparacaine HCl en el área del ojo para preve sequedad y dolor en los ojos NT. Ratones por 1 h de monitor y proceda a tejidos.
    3. Cosechar el tejido pulmonar como se describió anteriormente y la congelación de flash los pulmones.
    4. Cortar 20-30 mg de tejido congelado en hielo seco y registrar el peso exacto.
    5. Limpie suavemente el tejido con paños para absorber cualquier agua superficial.
    6. Coloque el tejido dentro de la ventana de la célula de tejido (un accesorio permite realizar mediciones de EPR para muestras de tejido) y ejecute el EPR para determinar el total de giros. Los datos se pueden expresar como total giros por mg de tejido.

5. Análisis de datos

  1. Simulación de los espectros EPR con SpinFit módulo incorporado en el software de xenón del espectrómetro EPR EMXnano de mesa. Determinar la concentración de nitróxido por el módulo de SpinCount. Alternativamente, puede realizarse una curva de calibración de un nitróxido estable como TEMPOL 4-hidroxi-TEMPO y la concentración puede obtenerse comparando la intensidad de la señal con la muestra y el patrón.
  2. Para los datos recogidos a 77 K, utilizar doble integración seguida por SpinCount.

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Resultados

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Detección de superóxido con CMH fue validada utilizando la X / superóxido XO genera el sistema para demostrar que la señal nitróxido (CM.) fue completamente inhibida por césped, mientras que la catalasa no tuvo ningún efecto (figura 1A). El superóxido extracelular, total luego fue evaluado en células RAW 264.7 células de incubación con la sonda de spin CMH permeable a la célula +-pretratamiento de SOD. Se midió la concentración de nitróxido en la s...

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Discusión

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La evaluación de la producción de radicales libres en entornos biológicos es importante en redox entendimiento reglamentado en salud y la enfermedad, pero la medida de estas especies es muy difícil debido a la corta vida media de las especies de radicales libres y técnicas limitaciones de los métodos comúnmente utilizados. EPR es una herramienta valiosa y poderosa en biología redox, ya que es el método sólo inequívoco para detectar radicales libres. En este proyecto demostramos métodos prácticos de EPR para diseñar exper...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por la Universidad de Colorado escuela de medicina Decano concesión de infraestructura de investigación estratégica, R01 HL086680-09 y 1R35HL139726-01, al Premio de beca E.N.G. y UCD CFReT (él). Los autores agradecen a Dr. Sandra Eaton y el Dr. Gareth Eaton (Universidad de Denver), Dr. Gerald Rosen y Dr. Joseph P. Kao (Universidad de Maryland) y Dr. Sujatha Venkataraman (Universidad de Colorado Denver) para discusiones útiles y Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie y Ivy McDermott (Universidad de Colorado Denver) para el soporte técnico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMLifeTech10566-016medios de cultivo celular
Dietilentriaminoácido pentaacético (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
cloruro de sodio (NaCl) Fisher Scientific   BP358-212utilizado para preparar 50 mM de tampón salino de fosfato   según Sigma aldrish    
fosfato de potasio dibásico (HK2PO4 )Fisher Scientific   BP363-500utilizado para preparar 50 mM de tampón salino de fosfato  según Sigma aldrish   
fosfato de potasio monobásico (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379utilizado para preparar 50 mM de tampón salino de fosfato   según Sigma aldrish    
Tampón Krebs-Henseleit (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Superóxido dismutasa de eritrocitos bovinos (SOD)Sigma Aldrich  S7571-30KU
Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGDisolver en DMSO
Antimicina A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGDisolver en etanol y almacenar en viales de vidrio (MW utilizado es el peso molecular promedio para cuatro lotes)
1-Hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina . HCl (CMH)Enzo Ciencias de la VidaALX-430-117-M050
1-hidroxi-3-carboxi-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina . HCl (CPH)Enzo Ciencias de la VidaALX-430-078-M250
1-Hidroxi-4-[2-trifenilfosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1-Hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-4-[2-(trifenilfosfonio)acetamido]dicloruro de piperidinio ( mito-TEMPO-H)Enzo Ciencias de la VidaALX-430-171-M005
Cloruro de 1-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-4-il-trimetilamonio . HCl (CAT1H)Enzo Ciencias de la VidaALX-430-131-M250
Heparina Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Cloruro de difeniliodonio Sigma Aldrich43088
Sal de mesilato de deferoxaminaSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
MARCA desechable BLAUBRAND  micropipetas, intraMarkSigma Aldrich708733capilares
TUBO FRACCIONADO DE FLUOROPOLÍMERO DE PTFE
3/16" Diámetro exterior x 1/8" ID		NORELL1598774ATubo de teflón 
TAPONES DE CAUCHO DE SILICONA PARA TUBOS DE MUESTRA DE RMN  PARA TUBOS DE PARED DELGADA CON UN DIÁMETRO EXTERIOR DE 4 mm-5 mm (3,2 mm A 4,2 mm DE DIÁMETRO INTERIOR) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Espectrómetro EPR de sobremesa Bruker BioSpin GmbHE7004002
CÉLULA DE TEJIDO NANO EMXBruker BioSpin GmbHE7004542

Referencias

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