Artículo de método

Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto

DOI:

10.3791/58476

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7 de enero de 2019

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1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

En este artículo

Resumen

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Describimos un interno diseñado en vitro cámara modelo de flujo, que permite la investigación de la adherencia bacteriana a los tejidos de injerto.

Resumen

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Varios conductos de válvulas y válvulas montada en stent se utilizan para reemplazo de la válvula de salida de ventrículo derecho (TSVD) de la zona en pacientes con enfermedad cardíaca congénita. Al utilizar materiales protésicos sin embargo, estos injertos son susceptibles a infecciones bacterianas y varias respuestas de host.

Es la identificación de factores bacterianos y host que juegan un papel vital en endovascular adherencia de microorganismos de importancia para comprender mejor la fisiopatología de la aparición de infecciones como la endocarditis infecciosa (EI) y desarrollar la prevención estrategias. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de modelos competentes para investigar adherencia bacteriana bajo condiciones fisiológicas del esquileo. Aquí, describimos el uso de un nuevo diseño en vitro perfusión cámara basado en placas paralelas que permite que el estudio de la adherencia bacteriana a diferentes componentes de los tejidos del injerto expuso como matriz extracelular, las células endoteliales y áreas inertes . Este método combinado con la formación de Colonia unidad (UFC) de conteo es adecuada para evaluar la propensión de los materiales de injerto hacia adherencia bacteriana bajo flujo. Además, podría utilizarse el sistema de cámara de flujo para investigar el papel de los componentes de la sangre en la adhesión bacteriana bajo condiciones de corte. Hemos demostrado que el origen del tejido, su morfología superficial y la especificidad de especies bacterianas no son los principales factores determinantes en la adhesión bacteriana a tejidos de injerto utilizando nuestro modelo interno diseñado en vitro de la perfusión.

Introducción

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Staphylococcus aureus (S. aureus) emplea una variedad de estrategias de virulencia para eludir el sistema de defensa inmune huésped colonizar superficies biológicas o no biológicas implantadas en la circulación humana, que conduce a infecciones intravasculares graves como sepsis y IE1,2,3,4,5. Restos de IE un importante tratamiento asociado de complicación en los pacientes después de la implantación de válvulas cardíacas protésicas y factores individuales que contribuyen a la aparición de IEare no todavía completamente entendido6,7. Bajo condiciones de flujo, las bacterias encuentran fuerzas de esquileo, que necesitan vencer para adherirse a la pared de vaso8. Modelos, que permiten estudiar la interacción entre bacterias y tejido de válvula protésica o endotelio bajo flujo, son de interés ya que reflejan la situación en vivo más.

Varios mecanismos específicos facilitan la adherencia bacteriana a las células endoteliales (ECs) y la matriz subendothelial expuestas (ECM) hacia la colonización de tejidos y la maduración de la vegetación, siendo los primeros pasos esenciales en IE9. Diversas proteínas superficiales Estafilocócicas o MSCRAMMs (componentes superficiales microbianos reconociendo las moléculas adhesivas de la matriz) han sido descritos como mediadores de adherencia a las células del huésped y las proteínas de la ECM interactuando con moléculas como la fibronectina, fibrinógeno, colágeno y von Willebrand factor (FvW)8,10,11. Sin embargo, en vista de plegamiento intra moleculares de algunos factores de virulencia, sobre todo estudiados en condiciones estáticas, muchas de estas interacciones pueden tener diferente importancia en infecciones endovasculares en la sangre circulante.

Por lo tanto, presentamos un casa diseñada en vitro placas paralelas cámara modelo de flujo, que permite la evaluación de la adherencia bacteriana a diferentes componentes de la ECM y ECs en el contexto de los injertos de tejido implantado en la posición del TSVD. El propósito general del método descrito en este trabajo es estudiar los mecanismos de interacción entre las bacterias y los tejidos subyacentes de endovascular en condiciones de flujo, que están estrechamente relacionadas con el medio ambiente en vivo de los agentes patógenos de la sangre tales como S. aureus. Este nuevo enfoque se centra en la susceptibilidad de las superficies de tejido de injerto a la adherencia bacteriana para identificar posibles factores de riesgo para el desarrollo de la IE.

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Protocolo

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1. preparación de tejidos de injerto In Vitro estudios

Nota: Se utilizaron tres tipos de tejidos: parche de pericardio bovino (BP), injertos de homoinjerto criopreservado (CH) y la vena yugular bovina (BJV). En caso de conducto BJV y CH (tejido por el Banco Europeo de homoinjerto (EHB) y almacenado en nitrógeno líquido antes de usar), la pared y valvas valvulares fueron utilizados. Parche de BP y conducto BJV fueron comprados a los fabricantes. Antes de utilizar, descongele CH siguiendo las instrucciones de EHB12.

  1. Lavar todos los tejidos con 0.9% NaCl antes del uso.
  2. Preparar las biopsias de tejido mediante una biopsia de piel desechable punzón para cortar piezas de tejido circular (diámetro 10 mm).
  3. Corte todos los parches de tejido a la misma altura utilizando bisturís estériles desechables.
  4. Para los tejidos fijados con glutaraldehído (por ejemplo conducto BJV), incubar pedazos del injerto durante la noche a 4 ° C con 200 g/L de albúmina humana para neutralizar el fijador.
  5. Lave a residuos de glutaraldehído con 0.9% NaCl en una placa de microtitulación.  Repita 3 veces en 1 minuto.

2. preparación de las bacterias para los experimentos de perfusión

Nota: Se utilizaron tres cepas bacterianas: Cowan (ATCC 12598) de S. aureus , S. epidermidis ATCC 149900 y S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus y S. epidermidis fueron cultivadas a 37 º C en caldo de soja tríptica (TSB) y S. sanguinis fue aumentado a 37 ° C con 5% CO2 en caldo de infusión cerebro corazón (BHI).

  1. Preparar una noche cultura de bacterias en una placa de agar sangre sólida.
    1. Utilizar un bucle estéril raspe las bacterias congeladas y sembrar sobre una placa de Mueller-Hinton agar sangre para el cultivo durante la noche a 37 ° C.
  2. Utilizar un asa de inoculación estéril para recoger una sola Colonia de la cultura de agar sangre durante la noche e inocular en 10 mL de TSB o BHI en un tubo de 14 mL y cultura durante la noche a 37 ° C.
  3. Culturas durante la noche (3000 x g, 4 ° C, 10 min) de centrifugar y resuspender el pellet en 10 mL de tampón fosfato salino (PBS). Colocar tubos de 14 mL en hielo.
  4. Preparar una alícuota de la solución de 3,7 mg/mL de 5 (6) - carboxi - fluoresceína N-hidroxi-succinimidyl-éster (CF) en etanol y almacenar a-20 ° C. Diluir más el stock de la FQ a 150 μg/mL utilizando agua "ultrapura".
    Nota: Proteger los tubos de la luz con papel aluminio y almacenar a-20 ° C.
  5. Centrifugue las bacterias (3000 x g, 4 ° C, 10 min) y resuspender el pellet en 800 μl de PBS y añadir 200 μL de la solución de CF de 150 μg/mL (concentración final de 30 μg/mL utilizados para experimentos de perfusión). Proteger los tubos de la luz con papel de aluminio e incubar durante 30 min utilizando un agitador orbital.
  6. Después de etiquetar, bloque con el 2% de solución de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS y spin (3000 x g, 4 ° C, 10 minutos). Seguir con un paso de lavado con 10 mL de PBS y pellet de bacterias por centrifugación (3000 x g, 4 ° C, 10 minutos).
  7. Diluir las bacterias con PBS para obtener 107 las unidades formadoras de colonias (UFC) /mL (verificado por UFC recuento en placas de Mueller-Hinton agar sangre), que corresponde a un OD600 (densidad óptica) de 0.65. Mantener los tubos en la oscuridad en el hielo antes de experimentos de perfusión.
    Tenga en cuenta. Tenga en cuenta que las mediciones de600 OD reflejan el número aproximado de bacterias. Para contar la dosis de inoculación efectiva, el método de dilución seriada es un paso adicional es necesario para verificar la do números tal como se describe en la sección 3.8.

3. in vitro experimentos de perfusión usando una cámara de flujo de placas paralelas

  1. Biopsias de 10 mm de diámetro y del mismo grosor (preparada en los pasos 1.1-1.5) el montaje en un sistema de cámaras de flujo con la superficie interna hacia arriba para ponerse en contacto con la suspensión bacteriana.
    Nota: El mismo grosor de tejido a través de varios injertos garantiza que se alcanza la misma altura de tejido en el canal que permite el flujo laminar en todas las condiciones. Todos los elementos de la cámara de flujo se presentan y describen en la figura 1.
    1. Para comenzar el protocolo, coloque la pieza de tejido redondo entre un portaobjetos con una perforación circular de 8 mm y una Junta de goma.
      Nota: La diapositiva del microscopio posee la película ultra delgada inferior para permitir la generación del agujero de 8 mm. Junto con la hoja de goma, fija el tejido para permitir el contacto directo entre la muestra y el medio que fluye y también previene la dislocación de la biopsia durante el experimento. La superficie de los tejidos investigados, que se exposición al flujo (menor diámetro) no puede ser manipulada por el fórceps.
    2. Inserte el soporte con el tejido en la hoja de la Junta que está incrustada en la estructura metálica de la parte inferior de la cámara.
    3. Coloque el marco superior del metal con la correspondiente hoja de la Junta en la parte inferior de la cámara con el soporte de tejido previamente insertado. Posteriormente montar toda la cámara con ocho tornillos y tuercas de tornillo. Asegúrese de que la altura de la cámara es siempre la misma a través de injertos.
      Nota: La altura de la cámara debe determinarse siempre con los tornillos. Utilice un calibrador o la regla.
  2. Conecte la cámara de flujo con una bomba peristáltica y el depósito del líquido de los tubos.
  3. Perfusión de los tejidos con suspensiones de 107 CFU/mL (verificado por UFC cuenta y relacionados con la medición de OD600 ) marcada con fluorescencia bacterias en PBS con una tensión de cizalla de 3 Dina/cm2 (Dina por centímetro cuadrado la unidad de presión) por medio de la bomba peristáltica (flujo 4 mL/min) durante 1 h con un reservorio bacteriano 400 mL (diseño, figura 1) condicionado a 37 ° C con un termostato de la placa (Tabla de materiales).
  4. Recirculan continuamente la suspensión bacteriana de 100 mL con el mismo depósito de recolección.
  5. Después de la perfusión, desmontar la cámara para liberar el injerto y lavar la pieza de tejido dos veces con 4 mL de PBS en una placa de 12 pozos usando el agitador orbital de laboratorio por 3 minutos. Posteriormente cortar la parte interna de la prótesis mediante una biopsia de piel punch de un diámetro más pequeño.
  6. Coloque cada biopsia de tejido en un tubo separado 14 mL que contiene 1 mL de estéril 0,9% NaCl. Etiquetar el tubo # 1.
  7. Separar las bacterias de los tejidos mediante un baño de sonicación durante 10 min (amplitud = 100% y la frecuencia = 45 kHz).
    Nota: En comparación con desprendimiento completo de la bacteria de los tejidos los injertos deben ser evaluados sobre la incubación de los parches durante la noche a 37 ° C en medio líquido TSB seguido por medidas de OD600 para controlar manchas tratadas con una solución libre de bacterias.
  8. Use un método de dilución seriada en placas de Mueller-Hinton agar sangre para contar unidades formadoras de colonias.
    1. Preparar un tubo de solo 14 mL con 10 mL de solución salina estéril para hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana obtenida después de la sonicación. Etiquetar este tubo como #2.
      Nota: Para cada uno un tubo de tejido experimento con 10 mL de 0.9% NaCl es necesario.
    2. Preparar tres tubos de 14 mL con 10 mL de estéril 0,9% NaCl para diluciones seriadas de la suspensión bacteriana inicial del paso 2.7. Etiquetar los tubos de la siguiente manera #3, #4, #5.
      Nota: Este paso es necesario conocer el real número de UFC en la suspensión bacteriana utilizado para el experimento de la perfusión.
    3. Vórtice mezcle cada tubo de vórtice s. 15 los tubos con la biopsia de tejido, así como la suspensión bacteriana inicial para hacer diluciones seriadas.
    4. Preparar tres placas de agar, dos para el experimento de tejido (perfusión de bacterias y control de la perfusión de PBS) y el tercero de la suspensión bacteriana inicial utilizada para perfusiones.
    5. Etiqueta de tres sectores por placa para el experimento de tejido de la siguiente manera 10-1, 10-3 y 10-4. Para contar el número de unidades formadoras de colonias en la perfusates bacteriana, etiqueta de la placa como sigue: 10-1, 10-3, 10-5 y 10-7.
      Nota: Todas las indicaciones en el agar de las placas tales como 10-1, 10-3 consulte el número final de UFC/mL calculado en el día siguiente. Placa de control no requiere de cualquier sector. Antes del uso, placas de agar sangre deben ser colocadas debajo de la campana laminar y abiertas para eliminar el exceso de humedad.
    6. Para continuar la preparación de las diluciones seriadas, transfiera 100 μl del tubo #1 al tubo #2 y mezcla vigorosamente con vortex.
    7. Extensión 100 μl de los contenidos del tubo #1 y #2 en los correspondientes sectores 10-1 y 10-3 de la placa de agar. Asimismo, difundir 10 μl del tubo #2 en el sector 10-4, repetir este paso 4 veces para obtener 4 masas separadas de cada volumen de 10 μl.
      Nota: Debido al pequeño volumen utilizado para la galjanoplastia en el sector 10-4, se aconseja tener múltiples número de gotitas para hacer un número medio de UFC cultivadas.
    8. Para preparar las diluciones seriadas de la cultura inicial, transferir 100 μl de suspensión bacteriana de paso 2.7 al tubo #3 y mezcla vigorosamente con vortex. Añada 100 μl del tubo #3 al tubo #4 y mezclar bien, repita el procedimiento para el posterior tubo #5.
    9. Extensión 100 μl de los contenidos de los tubos #3, #4, #5 y la suspensión bacteriana ajustada (paso 2.7), respectivamente, en sectores 10-3, 10-5, 10-7 y 10-1 de la placa de agar sangre.
    10. Dejar las placas de agar sangre en la campana laminar de aire seco las extensiones bacterianas, normalmente durante 10 minutos. Luego, coloque las placas a 37 ° C para la incubación de noche.
    11. Después de la incubación durante la noche, contar las colonias de bacterias para obtener el número de unidades formadoras de colonias resultantes de la adhesión a las biopsias de tejido así como UFC/mL en la suspensión bacteriana inicial utilizada para la perfusión. Expresar resultados en ufc/cm2.

4. fluorescencia microscopía de bacterias adheridas a los tejidos con perfusión de injerto

  1. Después de la perfusión, lavar piezas de tejido con PBS (ver paso 3.5) y corte la parte interior de un injerto con un punzón de un diámetro más pequeño.
  2. Preparar una placa de 6 pozos y ponga gotas de medio de montaje (Tabla de materiales).
  3. Coloque cada pieza de tejido con su superficie inundada hacia abajo en una sola gota de medio de montaje.
  4. Leer un plato utilizando un escáner de fluorescencia (Tabla de materiales). Establecer los parámetros de excitación y emisión de longitudes de onda según un fluoróforo que se utiliza para el etiquetado bacteriana.

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Resultados

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Para comprender mejor los mecanismos detrás de IE desarrollo, este modelo permite la evaluación de bacterias y factores asociado del tejido presentan en la situación en vivo del inicio de la infección.

En detalle, el enfoque novedoso en vitro permite para cuantificar la adherencia bacteriana en condiciones de flujo a los tejidos de injerto diferentes por perfundiendo fluorescencia etiquetada bacteria s...

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Discusión

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Observaciones clínicas recientes dan especial sensibilización a IE como complicación en pacientes sometido a reemplazo de la válvula del TSVD6,13. Disfunción de la válvula implantada en IE es el resultado de la interacción bacteriana con el injerto endovascular conduce a extenso inflamatorios y procoagulantes reacciones1,14. El modelo presenta novela en vitro nos permitió investigar si las difere...

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Agradecimientos

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Este estudio fue patrocinado por una beca de la investigación fondo KU Leuven (OT/14/097) a RH. TRV fue Becario Postdoctoral de la Fundación de investigación FWO - Flandes (Bélgica; Concesión número - 12K0916N) y RH es apoyado por el fondo de investigación clínica de UZ Lovaina.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Parche de pericardio bovino (BP), Supple Peri-Guard PericardiumSynovis Surgical Innovations, EE. UU. PC-0404SN
Conductos de vena yugular bovina (BJV)Conducto de Contegra; Medtronic Inc, EE. UU.M333105D001
CH homoinjerto criopreservadoEuropean Homograft Bank (EHB)-
Acu-PunchAcuderm Inc, EE. UUP850 (8 mm); P1050 (10 mm)
albúmina humanaFlexbumin; Baxter, BélgicaBE171464
LOTE:16G12C
Caldo de soja tríptico (TSB)Fluka, Steinheim, Alemania22092-500G
Caldo de infusión cardíaca (BHI)Fluka53286-500G
Solución salina tamponada con fosfato (PBS).Gibco14190-094
5(6)-Carboxifluoresceína N-hidroxisuccinimida éster (CF)Sigma-Aldrich, Alemania21878-100MG-F
Bomba peristáltica (MODELO ISM444B)Ismatec BVP-Z Estándar; Cole Parmer, Wertheim, Alemania631942-2
Baño de sonicaciónLimpiador ultrasónico VWR; VWR, Radnor, PA142-6044230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen by ThermoFisherP36930
InCell Analyzer 2000 (escáner de fluorescencia)GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa29027886
Arium Pro VF - agua ultrapura - H2O MilliQMillipore87206462
Portaobjetos microscópicos - Cámaras de cultivo de tejidos (1 pocillo)Sarstedt94.6140.102
1 pocillo en Lumox desmontableSarstedt94.6150.101
Acero inoxidable - quirúrgico CuchillasSwann-Morton311
Tygon Tubo de silicona, 1/8" de diámetro interno x 1/4" de diámetro exteriorCole-ParmerEW-95702-06 Rango detemperatura: – 80 a 200 grados; C
Esterilizar: Con óxido de etileno, irradiación gamma o autoclave durante 30 min, 15 psi de presión
PharMed BPT TubingSaint-Gobain AY242012esterilizable en autoclave 30 min a 121 grados; C
Tygon LMT-55 TuboSaint Gobain Performance Plastics™
TermostatoBMG BIOMEDIZINTECHNIK300-0042230V, 90VA, 50Hz
. 15312022

Referencias

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