Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.
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Artículo de método
Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa
En este artículo
Resumen
Resumen
Estudios recientes de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) han proporcionado un gran cuerpo de información sobre los mecanismos espinales que transmisión sensorial, regulación nociceptiva y desarrollo crónico de dolor o picazón. Las implementaciones de las grabaciones electrofisiológicas junto con estudios morfológicos basados en la utilidad de rebanadas agudo de la médula espinal han mejorado nuestra comprensión de las propiedades neuronales y la composición de los circuitos locales en SG. Aquí, presentamos a una guía práctica y detallada para la preparación de la médula espinal rebanadas y mostrar representante celulares grabación y resultados morfológicos. Este protocolo permite la preservación neuronal ideal y puede imitar en vivo condiciones hasta cierto punto. En Resumen, la capacidad para obtener una preparación en vitro de segmentos de la médula espinal permite grabaciones estable de fijación de corriente y voltaje y así podría facilitar investigaciones detalladas en las propiedades intrínsecas de la membrana, circuitos locales y estructura neuronal utilizando diferentes aproximaciones experimentales.
Introducción
La sustancia gelatinosa (SG, lámina II del asta dorsal espinal) es un centro de relé sin lugar a dudas importante para la transmisión y regulación de la información sensorial. Se compone de interneurons inhibitorios y excitatorios, que reciben entradas de las fibras aferentes primarias, interneuronas locales y el sistema inhibitorio descendente endógena1. En las últimas décadas, el desarrollo de la preparación de rebanada aguda de la médula espinal y el advenimiento de la grabación de la abrazadera del remiendo de celulares ha permitido varios estudios sobre las propiedades electrofisiológicas y morfológicas intrínsecas del SG neuronas
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Protocolo
Todos los protocolos experimentales descritos fueron aprobados por el Animal ética Comité de Nanchang University (Nanchang, China PR, ética No.2017-010). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el estrés y el dolor de los animales experimentales. Las grabaciones electrofisiológicas realizadas aquí se llevaron a cabo a temperatura ambiente (RT, 22 – 25 ° C).
1. los animales
- Uso de ratas Sprague-Dawley (3 – 5 semanas) de ambos sexos. Los animales bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h de la casa y darles acceso ad libitum al agua y una alimentación adecuada.
2. preparación de solucione....
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Resultados
Medular aguda rebanadas se prepararon según el esquema mostrado en la figura 1. Después de rebanar y de recuperación, un trozo de médula espinal fue trasladado a la sala de grabación. Se identificaron las neuronas saludables basados en el aspecto de soma usando microscopia de IR-DIC. A continuación, los potenciales de acción de las neuronas de la SG fueron sacados por una serie de despolarización actuales pulsos (1 s de duración) cuando las neuronas se llevar.......
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Discusión
Este protocolo detalla los pasos para la preparación de rodajas de la médula espinal, que hemos utilizado con éxito cuando se realizan experimentos celulares patch-clamp SG neuronas18,19,20,21. Mediante la aplicación de este método, nos informó recientemente que la minociclina, una segunda generación de la tetraciclina, marcado podría aumentar la transmisión sináptica inhibitoria a través de un.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81560198, 31660289).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S7653 | Se utiliza para la preparación de ACSF y PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Se utiliza para la preparación de solución intracelular basada en ACSF, sacarosa-ACSF y K+ |
| NaH2PO4· 2H2O | Sigma | 71500 | Se utiliza para la preparación de ACSF, sacarosa-ACSF y PBS |
| CaCl2· 2H2O | Sigma | C5080 | Utilizado para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF |
| MgCl2· 6H2O | Sigma | M2670 | Se utiliza para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Se utiliza para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF |
| D-Glucosa | Sigma G7021 | Se utiliza para la preparación de ACSF | |
| Ácido ascórbico | Sigma | P5280 | Se utiliza para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF |
| Piruvato de sodio | Sigma | A7631 | Utilizado para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF |
| Sacarosa | Sigma | S7903 | Utilizado para la preparación de sacarosa-ACSF |
| K-gluconato | Wako | 169-11835 | Utilizado para la preparación de solución intracelular basada en K+ |
| Na2-Fosfocreatina | Sigma | P1937 | Se utiliza para la preparación de solución intracelular |
| EGTA | Sigma | E3889 | Se utiliza para la preparación de solución intracelular |
| HEPES | Sigma | H4034 | Se utiliza para la preparación de solución intracelular |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Se utiliza para la preparación de solución intracelular |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Se utiliza para la preparación de solución intracelular |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Se utiliza para la preparación de solución intracelular a base de Cs+ |
| CsCl | Sigma | C3011 | Se utiliza para la preparación de solución intracelular a base de Cs+ |
| TEA-Cl | Sigma T2265 | Se utiliza para la preparación de soluciones intracelulares a base de Cs+ solución | |
| Neurobiotina 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotina 488 podría ser utilizada para estudios morfológicos |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% bloque de agar se utilizó en nuestro protocolo |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | 4% se utilizó paraformaldehído para el procesamiento inmunohistoquímico |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reactivos | utilizados para la preparación de | |
| PBS Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1,5 g/kg, i.p. |
| Capilares de vidrio de borosilicato | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1,5 mm de diámetro exterior, 1,12 mm de diámetro interno |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instrument | P-97 | Se utiliza para la preparación de micropipetas |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Mesa de aislamiento de vibraciones | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Cámara CCD | infrarrojaDage-MIT | IR-1000 | |
| Amplificador de patch-clamp | Micromanipulador HEKA | EPC-10 | |
| Sutter Instrument | MP-285 | ||
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Microscopio vertical | Olympus | BX51WI | |
| Osmómetro | avanzado | FISKE 210 | |
| PH | Mettler Microscopio Toledo | FE20 | |
| Confocol | Zeiss | LSM 700 |
Referencias
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gela....
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Reimpresiones y permisos
