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Artículo de método

Desentrañando los jugadores claves de inmunidad Humoral: avanzada y Protocolo de aislamiento de linfocitos de parches Murine placas de Peyer

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DOI:

10.3791/58490

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21 de noviembre de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

En este artículo

Resumen

En este estudio, presentamos un novedoso y eficaz protocolo para el aislamiento de los linfocitos de las placas de Peyer (PP), que pueden utilizarse posteriormente para ensayos funcionales en vivo y en vitro como en estudios de citometría de flujo folicular t helper y células del centro germinal B.

Resumen

En la mucosa intestinal, células inmunes constituyen una entidad única de la inmunológica, que promueve la tolerancia inmunológica mientras que al mismo tiempo que confiere defensa inmune contra patógenos. Está bien establecido que placas de Peyer (PPs) tienen un papel esencial en la red inmune mucosa alojando varios efectoras T y células B subconjuntos. Una cierta fracción de estas células efectoras, ayudante T folicular (TFH) y las células de B de centro germinal (CG) se profesionalizó en la regulación de la inmunidad humoral. Por lo tanto, la caracterización de estos subconjuntos de la célula dentro de PPs en términos de su programa de diferenciación y propiedades funcionales puede proporcionar información importante sobre inmunidad mucosa. Para ello, un método fácilmente aplicable, eficiente y reproducible de aislamiento de linfocitos de PPs sería valioso para los investigadores. En este estudio, el objetivo fue generar un método efectivo para aislar los linfocitos de ratón PPs con rendimiento alto de la célula. Nuestro enfoque reveló ese tejido inicial procesamiento tales como el uso de reactivos digestivos y agitación de tejido, así como coloración condiciones y selección de los paneles de anticuerpos de la célula, tienen gran influencia en la calidad y la identidad de los linfocitos aislados y en resultados experimentales.

Aquí, describimos un protocolo permitiendo a los investigadores aislar eficientemente las poblaciones de linfocitos de PPs permitiendo reproducible flujo cytometry-evaluación de subconjuntos de T y células B centrándose principalmente en TFH y GC B subconjuntos de la célula.

Introducción

Todo el tracto gastrointestinal desde el principio hasta el final se viste de gala con una extensa red linfoide que contiene las células inmunes más que cualquier otro órgano humano y ratón1. Peyer de parches (PPs) constituyen un componente importante de la sección intestinal de esta organización celular inmune, llamado tejido linfoide asociado a intestino (GALT)2,3. En PPs, miles de millones de antígenos derivados de materiales alimenticios, patógenos y microbiota comensal que se muestrean continuamente, y cuando es necesarias respuestas inmunes adecuadas hacia ellos están montado así mantener inmune intestinal homeostasis. En ese sentido, PPs podría ser nombrado como "amígdalas del intestino". PPs consisten en compartimientos secundarios principales: cúpula subepitelial (SED), grandes zonas de folículos de células B; el epitelio suprayacente asociado folículo (FAE) y región interfollicular (IFR) donde las células T están ubicados4. Esta compartimentalización único de PPs permite subconjuntos de células efectoras diferentes a cooperar, por lo tanto, confiere inmunocompetencia en el intestino.

PPs carecen de vasos linfáticos aferentes, y por esta razón, antígenos transportados a PPs de intestino delgado no se están realizando a través de vasos linfáticos en contraste con la mayoría de los otros órganos linfoides. En cambio, las células epiteliales especializadas en FAE, llamadas células M, son responsables de la transferencia de antígenos luminales en el PPs5. Posteriormente, se recogen los antígenos transportados por las células dendríticas (DCs) y los fagocitos que se encuentran en la región de cúpula subepitelial (SED) debajo de la FAE6,7. Este proceso de clasificación de antígeno por DCs en el PP es crucial para iniciar la respuesta inmune adaptativa8 y posterior generación de IgA secretoras células9.

Debido a la pesada carga antigénica de flora comensal y del material alimenticio, PPs host endógeno activado efectoras T y células B subconjuntos en gran abundancia como células TFH y IgA+ GC B10, sugiriendo que el PPs representar un sitio de inmune activa respuesta11. Detección de hasta 20 – 25% células TFH en total CD4+ T compartimiento de la célula y hasta 10 – 15% GC B células dentro de células B totales es posible en PPs obtenidos de ratones C57BL/6 jóvenes inmunizados12. En contraste con otros tipos de células del ayudante de T (es decir., Th1, Th2, Th17 células), TFH células muestran tropismo singular en los folículos de células B principalmente debido a CXCR5 expresión, que promueve la TFH celular autoguiado hacia el blanco a lo largo de la gradiente de CXCL1313. En las zonas de folículos de células B de PPs, las células de la TFH inducir IgA clase interruptor de recombinación y la hipermutación somática en células B activadas que las células productoras de IgA de alta afinidad diferencian14. Posteriormente, estas células plasmáticas secretoras de anticuerpos migran a la lámina propia (LP) y regular la homeostasis inmune en la tripa10.

Identificación y caracterización de poblaciones celulares TFH y B GC dentro de PPs podrían permiten a los investigadores a investigar la dinámica de la respuesta inmune humoral bajo condiciones de estado estacionario sin la necesidad de modelos de inmunización desperdiciador de tiempo utilizado tradicionalmente en TFH-GC B celular estudios15,16,17,18. Analizando las células de la TFH en PPs no es tan fácil como otros subconjuntos de la célula. Desafíos técnicos incluyen la identificación de condiciones de preparación de tejido ideal, combinación de anticuerpo-marcador superficial, así como seleccionar los controles positivos y negativos adecuados. Campos de investigación TFH y PP muestran gran variabilidad en términos de procedimientos experimentales y están lejos de conferir un consenso para establecer protocolos estandarizados debido a varias razones. En primer lugar, cada subconjunto celular en PPs tiende a ser afectados diferencialmente por las condiciones de preparación de tejido que requieren más modificaciones de manera de subconjunto específico de célula. En segundo lugar, existe una discrepancia significativa entre los métodos reportados con respecto a los detalles de preparación de la célula de PPS. tercero, el número de estudios comparativos basados en el protocolo de investigación de técnicas de preparación de tejido ideal y condiciones experimentales para el PP y TFH investigación es bastante limitada.

Los estudios actuales basados en el protocolo sugeridos por PP celular preparación19,20,21,22 no eran TFH o GC orientado a la célula de B. Por otra parte, se encontraron algunas condiciones de preparación de tejido recomendados PPs19,20 como base de colagenasa digestión afectar negativamente el resultado de la identificación de TFH por citometría de flujo18. Sobre esta base, razonamos que un protocolo optimizado, estandarizado y reproducible que puede utilizarse para estudiar la dinámica celular TFH y B GC en PPs sería valioso para los investigadores trabajando sobre este tema. Esta necesidad nos dio el impulso para generar un protocolo mejorado y actualizado para el aislamiento y la caracterización de los linfocitos PP que finalmente está optimizado para la recuperación celular, viabilidad y eficiencia para la caracterización de citometría de flujo de varios T y B subconjuntos de la célula. También decidimos excluir varios pasos de preparación laboriosa sugeridos en anteriores protocolos, por lo tanto, reducir las manipulaciones necesarias y tiempo para la preparación de tejidos y células de PPs.

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Protocolo

Todos los estudios y experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo bajo los lineamientos de acuerdo institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC), de Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. diseño de montaje Experimental y grupos de ratón

  1. (Opcional) Co casa de los ratones experimentales para facilitar la transmisión horizontal de la microbiota intestinal entre ratones experimentales y para reducir la variabilidad no específicos dentro de los linfocitos PP. Además, utilizar controles littermate del mismo género para reducir al mínimo variabilidad.

2. extirpación y pasos de preparación de tejidos:

  1. Extirpación quirúrgica del intestino delgado (SI)
    1. Eutanasia a ratones con CO2 asfixia o cualquier método equivalente aprobado por el Comité institucional de ética animal.
    2. Transferir el ratón a un área específica para la supresión quirúrgica. Coloque la parte trasera hacia abajo y desinfecte el abdomen con etanol al 70%. Realizar una laparotomía cortando la piel abdominal y el peritoneo a lo largo de la línea media del pubis a las costillas, abriendo la cavidad peritoneal.
      Nota: Realizar la primera incisión en un área relativamente pequeña de la piel para evitar penetrar en la cavidad peritoneal y dañar el tejido intestinal. Continuar la supresión hasta frontera anatómica deseada.
    3. Identificar el intestino ciego, que es un punto de referencia ideal para la detección del íleon terminal, que constituye el segmento distal del intestino delgado.
      Nota: El ciego se encuentra generalmente en la parte inferior izquierda del abdomen de ratón.
    4. Determine la ensambladura ileocaecal y hacer un corte a este nivel tan distal como sea posible separar el intestino delgado del intestino ciego. A lo largo de los próximos pasos, evitar excesivo contacto físico con la pared intestinal porque PPs frágil colapsan fácilmente al tacto.
    5. Retire con cuidado el intestino entero hasta el esfínter pilórico cortando el mesenterio con unas tijeras. Identificar a la unión entre el píloro y el duodeno, y cortar el duodeno en este nivel, que dará lugar a la completa separación del intestino de la cavidad abdominal.
      Nota: (i) evitar la hiperextensión ya que podría causar la ruptura de la pared intestinal. (ii) si se desea el aislamiento de linfocitos LP además linfocitos PP, extirpación completa de la grasa mesentérica es necesario. Sin embargo, para el aislamiento del PP sólo, quedando la grasa mesentérica podría proporcionar algunos beneficios durante los pasos posteriores de aislamiento; por lo tanto, debe ser preservado.
    6. Lugar separado intestino en una placa de 6 pozos llenos de RPMI frío + 10% suero bovino fetal (FBS) y frote suavemente los tejidos manualmente hasta que todos los segmentos intestinales se introducen en los medios de comunicación fríos. Mantener los tejidos en el hielo a lo largo de los próximos pasos.
    7. Después de disecar el número deseado de intestino de ratón, proceda a la supresión de PP de recogidas intestino.
  2. Supresión quirúrgica de PPs y la preparación de la suspensión celular solo:
    1. Transferir el intestino pequeño en una toalla de papel por la grasa mesentérica con unas pinzas de agarre y colocar la cara mesentérica de la toalla de papel. Humedezca el segmento intestinal todo con fría RPMI + 10% FBS para evitar la deshidratación del tejido y la viscosidad.
      Nota: Queda la grasa mesentérica puede ser útil en esta etapa porque segmentos de tejido adiposo en el sitio mesentérico de SI se adhieren a la toalla de papel manteniendo el sitio anti-mesentérico hacia arriba.
    2. Identificar el PPs, que aparecen como blancos agregados múltiples lobulados en forma de "coliflor-como" en el lado anti-mesentérica de la pared intestinal.
      Nota: Flushing el contenido luminal no se recomienda hasta que todos los PPs son suprimidos. Vaciar el contenido luminal podría causar el colapso de las PPs y evitará que el contraste de color entre el PPs y la pared intestinal, que es muy útil para la identificación visual de PPs.
    3. Tras la identificación de PPs en el lado anti-mesentérico, colocar la tijera quirúrgica del extremo curvado en PPs (curva debe mirar para arriba) que el PP su borde distal y proximal.
      Opcional: Pulse el PP suavemente hacia las cuchillas de la tijera con la yema del dedo. Esta maniobra conducirá a la exclusión mejor de PP no tejido circundante. Suprimir el PPs suavemente, excluyendo el tejido intestinal circundante.
      Nota: (i) este paso es crucial para obtener máximo rendimiento de células PP reduciendo al mínimo la contaminación de la célula vecina intestinales compartimientos como LP y el epitelio intestinal, que también son ricos en células T. (ii) de uno SI de ratón C57BL/6, 5-10 PPs (tamaño medio, múltiples lobulada) pueden recogerse. Apuntando más pequeños PPs (no multi-lobulados), colección de hasta 12-13 PPs por ratón (C57BL/6) es posible usando este protocolo.
    4. Transferencia el PPs suprimidas a una placa de cultivo de tejidos 12-bien lleno de helado RPMI + 10% FBS y mantenidas en hielo con pinzas o tijeras quirúrgicas curvas.
      Nota: (i) inmediatamente después de la supresión de PPs, moco y contenido intestinal en la superficie PP pueden limpiarse frotando suavemente el tejido sobre una toalla de papel. Este paso ayudará a mejorar la viabilidad de los linfocitos PP. (ii) en vez de transferir el PPs a una placa, separado tubos de transferencia también se puede considerar dependiendo del número de la muestra total.
    5. Opcional: Al PP la supresión y posterior colocación en la placa de la pozo se ha completado, el número y tamaño de PPs de grupos experimentales/ratón diferente se pueden documentar tomando una foto de la placa de cultivo de tejidos que contienen PPs.
    6. Preparar un conjunto de tubos cónicos de 50 mL con 25 mL de RPMI + 10% FBS (previamente calentado a 37 ° C). Con un par de tijeras, corte el borde de una 1.000 μl Punta de la distancia que permite la aspiración de las PPs con pipeta de 1 mL. Aspire el PPs con pipeta de 1 mL y transferirlas desde la placa de cultivo de tejidos 12-bien a los tubos cónicos de 50 mL preparado.
      Nota: Utilice una nueva punta para cada muestra de ratón para evitar la contaminación cruzada entre las muestras.
    7. La tapa y coloque los tubos en posición vertical en un agitador orbital a 37 ° C, con agitación continua a 125 – 150 rpm durante 10 minutos. Mientras tanto, preparar un nuevo conjunto de tubos de 50 mL y colocar un filtro de célula 40 μm en la parte superior de cada tubo, a través del cual se preparará la suspensión unicelular.
      Nota: (i) el paso de agitación eliminará los restantes desechos contenidos, moco y células intestinales, que disminuyen la viabilidad celular y la recuperación de los linfocitos PP si no se. (ii) no se aplican ningún tipo de enzimas digestivas en tejido PP debido a que el proceso de digestión provoca una pérdida dramática de CXCR5 expresión de la superficie de la célula.
    8. Después de la agitación, transferencia el PPs a la coladera de la célula de 40 μm colocada en la parte superior de los tubos recién preparado cónico 50 mL. Usando el lado redondeado de un émbolo de la jeringa de 10 mL, suavemente interrumpir el PPs a través de la coladera de célula para generar suspensión unicelular. Enjuague el filtro con 15 – 20 mL de RPMI frío + el 10% FBS.
      Nota: (i) antes de la filtración, agite los tubos que contienen el PPs horizontalmente. Esta sacudida corta facilitará a la transferencia de PPs en los filtros de la célula. (ii) utilizando un colador de celular de 70 μm para el aislamiento de las células inmunitarias no-linfoide (por ej., monocitos, macrófagos, DCs) se recomienda.
    9. Centrifugar la suspensión unicelular a 350-400 x g durante 10 min a 4 ° C.
    10. Desechar el sobrenadante y resuspender las células a una concentración de 10 x 106 células/mL. Contar las células usando un hemocitómetro.
      Nota: (i) antes al conteo de células, el número total de células para cada grupo de ratón PP puede ser aproximadamente estimado utilizando la siguiente fórmula: "0.5-1 x 106 células x (número de PPs) = recuento total". Más diluciones con trypan azul para el recuento celular pueden ser necesarias. (ii) como una alternativa al conteo manual, pueden utilizarse contadores celulares automatizados.
    11. Transferencia de 2-2.5 x 106 células en volumen apropiado (por ej., 200 μL) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
      Nota: Para el solo color y las muestras control negativo, 0.5-1 x 106 células podrían ser suficientes.
    12. Centrifugar la placa a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Película de la placa.
    13. Lavar las células en 200 μL de tampón de tinción.

3. tinción de anticuerpo superficial

  1. Tinción de viabilidad:
    1. Después del último lavado, resuspender las células en 100 μL de viabilidad pueden corregir tinte diluido en PBS (1:1, 000). Incubar durante 30 min en hielo o a 4 ° C en la oscuridad.
      Nota: (i) intracelular de tinción para la detección de la transcripción clave factores como Foxp3 o Bcl-6 requiere la fijación de las células. En ese caso, la viabilidad no fijable colorantes (ej., 7-AAD, DAPI) no puede utilizarse. (ii) para diluir el tinte viabilidad fijable, no use cualquier tampón de tinción que contiene proteína. Los medios utilizados en este paso deben ser libre de proteína. (iii) exclusión de células muertas usando tinción de viabilidad es crucial porque las células muertas pueden causar serias dificultades técnicas en flujo cytometry análisis emitiendo Autofluorescencia y atando un, anticuerpos de superficie que podría conducir a falsas resultados positivos.
    2. Lavan las células dos veces con tampón de tinción. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Película de la placa.
  2. Bloque de FC y superficie - capa I:
    1. Preparar la solución de Fc-bloque mediante la dilución del anticuerpo anti-CD16/32 (1: 200) en tampón de tinción.
    2. Resuspender las células en 20 μL de la solución preparada de Fc-bloque. Incubar por 15 min en hielo.
    3. Sin lavar, agregar 80 μL de anticuerpo superficial de cóctel (ver tabla 1 para el anticuerpo Resumen) preparados en diluciones adecuadas. Incubar en hielo durante al menos 30 minutos.
    4. Lavar dos veces mediante la adición de tampón de tinción excesiva. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Película de la placa.
  3. Superficie - capa II:
    1. Preparar la solución de tinción de estreptavidina diluyendo fluorocromo conjugado estreptavidina en tampón de tinción.
    2. Después del último lavado, resuspender las células con 100 μL de estreptavidina previamente diluido (1: 100) solución de tinción. Incubar durante al menos 15 minutos en hielo en la oscuridad.
    3. Lavar dos veces con tampón de tinción. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4° C. Película de la placa.
      Opcional: Si tinción intracelular para la detección de la célula T reguladora folicular no se desea, después del último lavado, resuspender las células en 200 μL de tinción de buffer y transferencia en tubos apropiados para adquirir datos en citómetro de flujo. Cuando las muestras no son fijos, adquisición de datos mediante citometría de flujo se debe realizar dentro de 3 – 4 h para obtener resultados precisos.

4. fijación de la célula

  1. Preparar solución de trabajo de fijación/permeabilización (Fix/Perm) reactivos de Foxp3/transcripción Factor tinción búfer establecido. Mezclar una parte de la fijación/permeabilización concentrado con tres partes de fijación/permeabilización diluyente en el volumen final deseado.
  2. Después del último lavado, resuspender las células en 200 μL de solución de trabajo de Fix/Perm.
  3. Incube la placa en hielo o a 4 ° C por 20 min. Exceder los 20 minutos para este paso. Tiempo de incubación podría disminuir seriamente la recuperación de la célula.
  4. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Película de la placa. (Opcional) Después de este paso, fija las células pueden almacenarse durante varios días a 4 º C en tampón que contiene albúmina de suero bovino (BSA) de tinción o FBS hasta posterior intracelular manchas o flujo cytometry adquisición.
  5. Resuspender las células en 200 μL de permeabilización Buffer (x1) recién diluido previamente en agua purificada desionizada.
  6. Centrifugue a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
  7. Una vez lavado con 200 μL de buffer de permeabilización y centrifugue a 350 x g durante 5 min a TA.

5. intracelular de tinción

  1. Preparar la solución de Fc-bloque mediante la dilución del anticuerpo anti-CD16/32 (1: 200) en buffer de permeabilización.
    Nota: Después del paso de la fijación, las células deben mantenerse en buffer de permeabilización hasta el final del proceso de tinción intracelular.
  2. Después del último lavado, resuspender las células en 20 μL de solución de Fc-bloque. Incubar durante 10-15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  3. Sin lavar, agregar 80 μL de intracelular anticuerpo cóctel (volumen final de 100 μL) previamente diluido en buffer de permeabilización. Incubar durante 30 min a TA.
  4. Añada 100 μL de Buffer de Perm y centrifugue a 350 x g durante 5 min a TA.
  5. Una vez lavado con 200 μL de buffer de permeabilización, centrifugar a 350 x g durante 5 min a TA.
  6. Después del último lavado, resuspender las células en 200 μL de tampón de tinción y las células de transferencia en tubos adecuados (volumen final de 400 μL de tampón de tinción) y adquirir datos por citometría de flujo. Muestras teñidas en placa de 96 pocillos se pueden funcionar también sin transferir a tubos si se dispone de un citómetro de flujo con la opción de lector de la placa. Este paso minimiza la pérdida de la célula durante la transferencia de la célula.
  7. Adquirir un mínimo de 5 x 105 células totales en el citómetro de flujo para poder realizar análisis reproducibles de ESF, TFR, así como células B GC.

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Resultados

En contraste con un anterior protocolo20, hemos observado que PPs no se distribuyen uniformemente a lo largo de la is, pero se localizan más densamente hacia el extremos distal y proximal de la is como se muestra en figura 1A. Análisis cytometric del flujo demostró que, si siguen correctamente nuestro protocolo da una población de linfocitos PP que demuestra la distribución de dispersión hacia delante...

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Discusión

Aquí, describimos un protocolo optimizado para caracterización de citometría de flujo de células TFH y B GC. Una de las principales ventajas de nuestro protocolo es que permite el aislamiento de hasta 107 (promedio 4 a 5 x 106 células) total PP las células de un ratón (cepa C57BL/6) sin ningún proceso digestivo. Observamos que el rendimiento total de la célula se correlacionó positivamente con el número de PPs y que podría estimarse de la siguiente ecuación simple que es útil para la planificación e...

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Divulgaciones

No hay conflicto de interés declarado.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Laura Strauss y Peter Sage para discusiones útiles y ayuda con los análisis de citometría de flujo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
anticuerpo CD4 contra ratoneseBioscience, Biolegend*17-0041-81 ,10054*Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
anticuerpo CD19 contra ratoneseBioscienceMA5-16536Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
anticuerpo PD-1 contra ratoneseBioscience61-9985-82Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
Anticuerpo anti-ratones ICOSeBioscience12-9942-82Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
anti-ratón GL7 anticuerpo Biolegend144610Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
anti-ratón CXCR5 anticuerpo Biolegend*, BD Bioscience145512*, 551960Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
anti-ratón BCL-6 anti-ratón Biolegend358512Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
anti-ratón Foxp3 anticuerpoeBioscience17-5773-82Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
Estreptavidina-BV421BD Bioscience563259Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
Tinte de viabilidad fijableeBioscienceL34957Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
7AADBiolegend420404Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141Para obtener información detallada, consulte la Tabla 1
Colagenasa IIWorthingtonLS004176
Colagenasa IVWorthingtonLS004188
Foxp3/Juego de tampones de tinción de factor de transcripcióneBioscience00-5523-00
Placas de 6 pocillos, 12 pocillos y 96 pocillosFalcon/Corning353046,353043/3596
Tubos cónicos de 50 mLFalcon3520
40 y micro; colador de célulasm Falcon352340
10 mL émbolo de jeringaExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Agitador orbitalVWRModelo 200
Tijera
dentada fina
Tijera
de extremo curvoPinza curva pequeña

Referencias

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