Por la presente presentamos un protocolo para medir al lado de la cama la actividad endotoxina de muestras de sangre entera humana. El ensayo actividad de la endotoxina es una prueba simple de realizar y puede ser un biomarcador útil en pacientes en estado crítico con sepsis.
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Artículo de método
Ensayo de actividad de endotoxinas para la detección de endotoxemia de sangre completa en pacientes con enfermedades críticas
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Resumen
Resumen
El lipopolisacárido, también conocido como endotoxina, es un componente fundamental de las bacterias gramnegativas y desempeña un papel crucial en el desarrollo de la sepsis y el shock séptico. La identificación temprana de un proceso infeccioso que está evolucionando rápidamente a una enfermedad crítica podría provocar un tratamiento más rápido e intensivo, lo que podría conducir a mejores resultados para los pacientes. El ensayo actividad de la endotoxina (EA) se puede utilizar junto a la cama como un biomarcador fiable de la endotoxemia sistémica. Se ha demostrado repetidamente que la detección de niveles elevados de actividad de la endotoxina está asociada con un aumento de la gravedad de la enfermedad en pacientes con sepsis y shock séptico. El ensayo es rápido y fácil de realizar. Brevemente, después del muestreo, una alícuota de sangre entera se mezcla con un anticuerpo anti-endotoxina y con LPS añadido. La actividad de la endotoxina se mide como la ráfaga oxidativa relativa de neutrófilos cebados detectados por quimioluminiscencia. La salida del ensayo se expresa en una escala de 0 (ausente) a 1 (máxima) y se clasifica como "baja" (<0,4 unidades), "intermedia" (0,4–0,59 unidades) o "alta" (0,6 unidades). La metodología detallada y los fundamentos para la implementación del ensayo del EA se informan en este manuscrito.
Introducción
El Lipopolisacárido (LPS), también conocido como endotoxina, es un componente clave de la estructura de la membrana de las bacterias Gram-negativas (GN). Constituye alrededor del 10% de la pared celular, siendo vital para la integridad de la membrana externa y la homeostasis. Además, es un potente activador del huéspedsistema inmune innato 1,2.
La exposición in vitro de células innatas del sistema inmunitario a LPS conduce a cambios en la expresión de múltiples genes3. La administración de cantidades muy pequeñas de LPS en voluntarios humanos sanos desencadena la cascada de inflamación sistémica aguda, mientras que la sepsis y el shock séptico pueden surgir con mayores concentraciones de endotoxinas4,5.
La sepsis es una afección potencialmente mortal que, si no se reconoce de inmediato, puede conducir a la insuficiencia multiorgánica y la muerte. Los pacientes sépticos deben ser tratados de manera oportuna, con reanimación agresiva, terapia antibiótica adecuada, control óptimo de la fuente y estrategias de apoyo a los órganos. El diagnóstico de la etiología de la sepsis se basa principalmente en el reconocimiento clínico y la detección de patógenos basada en el cultivo6. Sin embargo, los resultados de cultivos microbianos pueden tardar hasta 48 h y no son concluyentes en hasta el 30% de los casos7. La identificación temprana y la intervención pueden conducir a mejores resultados del paciente. En pacientes en los que se sospecha sepsis, las decisiones a menudo se toman sobre la base de parámetros fisiológicos y bioquímicos, sin un signo claro de endotoxemia.
La medición de la actividad de la endotoxina (EA) se puede obtener mediante un ensayo comercial (ver Tabla de Materiales)en sangre entera. Se puede utilizar como biomarcador de endotoxemia sistémica para la estratificación temprana de la gravedad de la enfermedad, particularmente en pacientes con riesgo de desarrollar shock séptico8. El ensayo se utilizó para guiar la terapia de hemoperfusión de polimixina B en un ensayo clínico aleatorizado aleatorizado doble ciego publicado recientemente en pacientes con shock séptico9. En pacientes en estado crítico, el estudio MEDIC mostró un aumento de los niveles de EA que se asociará con la disfunción de múltiples órganos, la duración de la estancia de la unidad de cuidados intensivos (UCI) y la mortalidad10.
Se han desarrollado diferentes ensayos para detectar endotoxinas. El ensayo de lisato de amebotocitos de Limulus (LAL), ya sea como una prueba de gel-clot, turbidimétrica o cromogénica, ha sido hasta ahora el más adoptado para la estimación de la endotoxina sérica. Se basa en la capacidad de la endotoxina para inducir la coagulación de la hemolinfa del cangrejo herradura, Limulus polyphemus. Sin embargo, este ensayo tiene algunas limitaciones en términos de especificidad. En particular, también puede ser activado por productos microbianos distintos de la endotoxina, tales como componentes de la pared celular de hongos, y puede ser inhibido por varias proteínas plasmáticas humanas11.
Durante la última década la medición de EA ha sido desarrollada y validada como un biomarcador de endotoxemia circulante. En comparación con la prueba LAL, EA es más rápido y fácil de implementar en el entorno clínico. Además, se ha demostrado que es más preciso que la LAL en sangre entera, con mayor sensibilidad y especificidad, tanto in vitro como in vivo12.
A pesar de su implementación inicial como una herramienta de diagnóstico temprano para la rápida identificación de las bacterias GN como agentes causantes de sepsis, el nivel de EA también se ha estudiado como un biomarcador de la gravedad de la enfermedad. En este contexto, se ha demostrado que es particularmente útil evaluar el estado de hipoperfusión debido a una enfermedad crítica en curso, como el shock séptico o el síndrome de paro post-cardiaco13. Más recientemente, desde el desarrollo de sistemas de hemopurificación, también se ha propuesto un resultado positivo de EA como una herramienta de cribado para identificar con precisión los candidatos potenciales para dicha terapia14. Recientemente realizamos un estudio retrospectivo observacional sobre la prevalencia y la importancia clínica de los niveles altos tempranos de EA en 107 pacientes con shock séptico. En línea con otros resultados recientes, encontramos que EA es un marcador prometedor de la gravedad de la enfermedad en pacientes con shock séptico15.
El objetivo del presente manuscrito es describir el método para realizar el ensayo de EA, ya sea junto a la cama o en el laboratorio, y describir su uso potencial en un escenario representativo de choque séptico. Esta técnica puede detectar la actividad de LPS midiendo la ráfaga oxidativa mejorada en neutrófilos después de su cebado por complejos de un anticuerpo anti-endotoxina y LPS. El aumento de la explosión respiratoria se detecta mediante un quimioluminómetro y la cantidad de luz emitida se considera proporcional a la cantidad de endotoxina en la muestra de sangre. El ensayo requiere pocos reactivos, tarda unos 30 minutos en realizarse y utiliza tan poco como 40 s de sangre entera12.
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Protocolo
El protocolo se lleva a cabo de acuerdo con las directrices institucionales relativas al manejo de bioespecímenes humanos y siguiendo los procedimientos operativos estándar actuales de nuestro laboratorio clínico. El uso de datos de EA e información clínica de pacientes que se están probando sigue las directrices del comité de ética de investigación humana de nuestra institución.
1. Contenidos del equipo de laboratorio y del kit de ensayo
- Almacene el kit de EA a 2-8 oC cuando no esté en uso.
-
Cada prueba de EA consta de 5 tipos diferentes de tubos; utilizar cada uno para una parte diferente de la prueba (ver sección 2).
- Utilice #1 de tubos (el tubo "Control") para medir la actividad basal de la ráfaga oxidativa no específica de los neutrófilos del paciente en ausencia de un anticuerpo específico.
- Utilice #2 de tubos (el tubo "Muestra") para medir la ráfaga oxidativa en respuesta al complejo de anticuerpos LPS.
- Utilice #3 de tubos (el tubo "Max") para medir la ráfaga oxidativa máxima de los neutrófilos del paciente en respuesta a un exceso de endotoxina.
- Utilice tubos #4 (el tubo "LPS") como fuente de endotoxina exógena.
- Utilice tubos #5 ("tubo Aliquot") para el almacenamiento de sangre.
NOTA: Se proporcionan duplicados de tubos #1, #2 y #3 para un total de 8 tubos que se utilizarán para cada muestra de sangre que se está analizando (el frasco de reactivos de EA y la prueba de control de calidad se pueden utilizar para todas las pruebas contenidas en una bolsa).
- Recoger muestras de sangre del paciente en tubos estériles que contengan anticoagulante EDTA. Almacene muestras de sangre a temperatura ambiente antes de ejecutar la prueba de EA.
- Antes de iniciar la prueba, encienda el quimiluminómetro y la coctelera de la incubadora. Calentar la incubadora a una temperatura de 37oC.
- Idealmente, comience a procesar la muestra en un plazo de 30 minutos a partir de la recolección de sangre.
2. Ensayo de actividad de endotoxinas
- Prepare los tubos de prueba del EA para la muestra de sangre de cada paciente que necesita analizar. Ponga los tubos en bastidores de tubos. A continuación, retire las tapas.
- Con una combipipette, pipetee un volumen de 1 ml del reactivo eA de la botella en tubos #1 (tubo de control), #2 (tubo de muestra) y #3 (tubo máximo), cada uno de ellos por duplicado.
NOTA: Pipetear por el lado del tubo para evitar salpicaduras de solución de nuevo. - Mezcle la muestra de sangre del paciente invirtiendo suavemente el tubo de recolección de sangre durante 20 veces. Luego, pipeta 0,5 ml de sangre del paciente en #4 de tubo (tubo LPS max) y #5 de tubo (tubo aliquot). Tubo de vórtice #4 durante 10 s.
- Coloque los bastidores de tubos con todos los tubos de ensayo de EA en la coctelera de la incubadora. Cerrar la tapa e incubar durante 10 min a una temperatura de 37oC.
- Abra la tapa y retire los portatubos de la coctelera de la incubadora. Tubo de vórtice #5 (tubo Aliquot). Usando una punta estéril, pipetear 40 l de sangre en tubos #1 y #2, por duplicado.
- Tubo de vórtice #4 (tubo LPS). Usando la misma punta de pipeta, pipeta 40 l de sangre del tubo #4 en tubo #3 (tubo máximo), por duplicado.
- Vortex los seis tubos de ensayo finales (#1, #2, #3 y los duplicados respectivos), luego colóquelos de nuevo en sus bastidores.
NOTA: Asegúrese de que todos los tubos estén vórticos durante la misma cantidad de tiempo. - Vuelva a colocar los portatubos en la coctelera de incubación y cierre la tapa. Ajuste la agitadora de incubación a 100 rpm y, a continuación, inicie el movimiento durante 14 minutos.
- Inserte la tarjeta de chip con la etiqueta EA en el quimiluminómetro y pulse Start. Después de la incubación de 14 minutos, siga las instrucciones que se muestran en el quimiluminómetro para leer los tubos del EA en el orden correcto.
- Retírelo suavemente por cada tubo durante 10 s antes de colocarlo en el portamuestras del quimiluminómetro. Abra el cajón de muestras y coloque el tubo #1 en el soporte de la muestra. A continuación, cierre el cajón de muestra y espere a que la unidad de luz relativa (RLU) lea.
- Repita el paso 2.10 para el tubo 2 y el tubo 3.
- Repita el paso 2.10 para los tubos duplicados 1, 2 y 3.
NOTA: Trate de vórtice todos los tubos durante la misma cantidad de tiempo durante los pasos 2.10–2.12. - Una vez procesados todos los tubos, tenga en cuenta que los resultados del EA se calcularán e imprimirán automáticamente. Los niveles se expresan como unidades de eA y representan la media de las determinaciones duplicadas de las mismas muestras.
- Repita los pasos 2.2 a 2.13 para cada muestra de sangre que deba analizarse.
- Una vez completado el ensayo, guarde los tubos de ensayo y los reactivos de EA restantes a 2-8 oC durante un máximo de 30 días.
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Resultados
Un hombre de 72 años fue ingresado en el Departamento de Emergencias (ED) de un hospital urbano académico. Unos días antes había presentado a su médico de atención primaria quejándose de ardor al orinar. Se recomendó una terapia de curso corto con fosfomicina oral. Su historia clínica incluyó hipertensión, diabetes tipo 2 sin complicaciones e hiperplasia prostática benigna. Sus medicamentos incluían enalapril, atorvastatina, tamsulosina y metformina.
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Discusión
El shock séptico todavía hoy en día se asocia con una mortalidad de hasta el 40%, aunque esta tasa varía según los informes considerados16. La necesidad de biomarcadores novedosos y mejores es defendida por la mayoría de los expertos en los campos con el fin de ayudar a los médicos en el diagnóstico temprano, mejor manejo, y pronóstico de pacientes con shock séptico6.
Realizar una prueba de EA no requiere conocimientos técnicos previos ni equipos...
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Divulgaciones
Estor SpA cubrió el costo de la cuota de publicación y producción de video de la revista. Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Paolo Bragano y Lisa Mathiasen, Ph.D. por su revisión de la metodología del protocolo de ensayo. Dario Winterton, MD proporcionó una ayuda sustancial para revisar el manuscrito para el dominio del idioma inglés.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit | EAA Spectral Medical Inc. | Paquete EAAST-20 | con 20 pruebas + 1 control de calidad |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminómetro |
| Agitador de incubadora | GRANT | ES-20 | Mini-incubadora |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Instrumento de vórtice |
Referencias
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