Aquí, presentamos un protocolo de congelación y sección de tejido cerebral de varios animales como una alternativa de ahorro de tiempo a procesar solo cerebros. Esto reduce la variabilidad de coloración durante la inmunohistoquímica y reduce la proyección de imagen y tiempo cryosectioning.
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Artículo de método
Cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores
En este artículo
Resumen
Resumen
Histología e inmunohistoquímica son métodos de rutina de análisis para visualizar la anatomía microscópica y localizar proteínas en tejido biológico. En neurociencia, así como una plétora de otros campos científicos, se utilizan estas técnicas. Inmunohistoquímica puede hacerse en tejido deslizante montado o secciones flotan libremente. Preparación de muestras de diapositivas es un proceso intensivo de tiempo. El siguiente protocolo para una técnica, llamada el Megabrain, reduce el tiempo necesario para montaje y criosección tejido cerebral hasta un 90% mediante la combinación de varios cerebros en un solo bloque congelado. Además, esta técnica reduce la variabilidad entre rondas, en un gran estudio histoquímico de la coloración. La técnica actual se ha optimizado para el uso de tejido cerebral de roedor en el análisis de immunohistochemical aguas abajo; sin embargo, puede aplicarse a distintos campos científicos que utilizan cryosectioning.
Introducción
Aquí, presentamos el protocolo para un nuevo método, que llamamos Megabrain, convertido a criosección roedor múltiples cerebros al mismo tiempo para los procedimientos de inmunohistoquímica aguas abajo. Un Megabrain permite la producción de diapositivas individuales que contienen tejido de múltiples animales. Esta técnica ha sido optimizada para cortar secciones coronales de hemisferios de rata adulta 9 o 5 cerebros completos adulto, al mismo tiempo. Por lo tanto, la técnica es más aplicable en los estudios de immunohistochemical grandes o en otros análisis realizados en tejido de cerebro montada diapositiva de una cohorte grande de animales.
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Protocolo
Se ha optimizado la técnica Megabrain con todo y hemiseccionada cerebros de varones adultos de ratones C57Bl65, ratas Sprague-Dawley juvenil y ratas Sprague-Dawley adultas que fueron perfundido con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) seguido de transcardially de paraformaldehído al 4%6. Resultados similares se pueden lograr en otras cepas de ratón y rata, en ambos sexos y diferentes edades. El estudio para generar datos para este manuscrito utilizado ratas Sprague-Dawley juvenil y fue aprobado por el Comité de uso y cuidado Animal institucional de la Universidad de Arizona, y animales de experimentación fueron atendidos s....
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Resultados
Un resultado positivo para este procedimiento es tejido que se encuentra en la diapositiva, sin burbujas ni lágrimas, en la orientación en que fueron congelados. Las secciones de tejido son uniformemente aparte y fácilmente identificable debido a la buena colocación del cerebro en el OCT y la notación buena como se demuestra en la figura 1. Asumiendo que el tejido cerebral fue recogido de animales de una edad similar, y que el tejido fue alineado en los PTU, .......
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Discusión
Durante este procedimiento, debe considerar que la temperatura de lo Megabrain y sus alrededores debe ser constantemente monitoreada para evitar descongelar y volver a congelar el tejido. El cerebro puede sólo retirarse del congelador de-20 ° C hasta a 3 veces cada vez que se toca y de izquierda en el criostato, con una temperatura fluctuante más cálida, el tejido se descongela y refreezes, causando una jalea como textura y tejido anormal integridad10. Por lo tanto, es óptimo para cortar el Megabr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ninguna revelación.
Agradecimientos
Fondos de apoyo de la misión de PCH apoyó la investigación en este manuscrito. Los autores desean agradecer a Daniel Griffiths por tomar las imágenes utilizadas en las figuras.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Compuesto Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT (caja de 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Moldes de inclusión desechables | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand Pinzas/pinzas de punta fuerte, rectas, anchas y de punta fuerte de alta precisión | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL Viales de centelleo de HDPE con Tapón de polipropileno | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sacarosa, botella de polietileno 2,5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Es necesario compensar las concentraciones de sacarosa del 15% y del 30%. |
| 2-metilbutano (certificado), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Vasos de precipitados de forma alta | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand Termómetros de inmersión parcial de líquido en vidrio de uso general (-50 a +50 ° C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Espátula Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Hoja de afeitar | Grainger | 4A807 | |
| Hojas de micrótomo Edge-Rite | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Portaobjetos de microscopio (1" frost) - blanco | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (solución salina tamponada con fosfato) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Diluir a 1X antes de usar |
| 15 piezas de pinceles finos | |||
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck El mandril que se muestra en la Figura 4 fue hecho a medida por un técnico de laboratorio, sin embargo, hay tamaños similares disponibles para ordenar a otras empresas comercialmente. | Ciencias de la Microscopía Electrónica | EMS065 |
Referencias
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P.
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Reimpresiones y permisos
