Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo probado y comprobado para la purificación del cloroplasto importación complejos (complejo TIC TOC) usando la etiqueta de grifo. El protocolo de aislamiento de afinidad de un paso potencialmente se puede aplicar a cualquier proteína y se utiliza para identificar a nuevos socios de interacción por espectrometría de masas.

Resumen

Biogénesis del cloroplasto requiere la importación de miles de proteínas codificadas por el núcleo en el Plastidio. La importación de estas proteínas depende del translocon en el exterior (TOC) y membranas internas de cloroplasto (TIC). Los complejos de TOC y TIC son multiméricas y probablemente contienen componentes desconocidos. Uno de los principales objetivos en el campo es establecer el inventario completo de componentes de TOC y TIC. Para el aislamiento de complejos de TIC TOC y la identificación de nuevos componentes, el receptor preprotein que toc159 ha sido modificado N-terminal mediante la adición de la etiqueta de purificación (TAP) de afinidad tándem en TAP-TOC159. La etiqueta de TAP está diseñada para dos pasos de purificación de la afinidad secuencial (por lo tanto "afinidad de tándem"). La etiqueta de llave utilizada en estos estudios consiste en un dominio N-terminal de unión de IgG derivado de proteína de Staphylococcus aureus (ProtA) seguido por un péptido de unión a calmodulina (CBP). Entre estas etiquetas de dos afinidad, un tabaco etch escote de proteasa del virus (TEV) ha incluido el sitio. Por lo tanto, proteasa TEV puede utilizarse para elución suave de complejos que contienen TOC159 después a cuentas de IgG. En el protocolo presentado aquí, se omite el segundo paso de purificación de afinidad de calmodulina. El protocolo de purificación comienza con la preparación y la solubilización de las membranas celulares total. Después del tratamiento de detergente, las proteínas de membrana solubilizadas se incuban con granos de IgG para el immunoisolation de los complejos que contienen grifo-TOC159. Vinculante y lavado extenso, complejos que contienen grifo TOC159 son troceados y liberados de los granos de IgG mediante la proteasa TEV por el que se quita el dominio de unión de IgG de S. aureus . Western blot de los aislados complejos que contienen TOC159 pueden utilizarse para confirmar la presencia de proteínas conocidas o sospechas de TOC y TIC. Más importante aún, los complejos que contienen TOC159 han sido utilizados exitosamente para identificar nuevos componentes de los complejos de TOC y TIC por espectrometría de masas. El protocolo que presentamos potencialmente permite el aislamiento eficaz de cualquier proteína de membrana-limitan complejos para ser utilizado para la identificación de componentes desconocidos por espectrometría de masas.

Introducción

Las plantas dependen de cloroplastos para la fotosíntesis y crecimiento Chlorobiaceae¹. La gran mayoría de las proteínas del cloroplasto es codificada en el núcleo, sintetizada en el citosol e importada en el cloroplasto a través de los complejos en los sobres de las membranas²TIC y TOC. La base de la tabla de contenido complejo consiste en el canal proteína-que conduce Toc75 y los dos receptores GTPases Toc33 y Toc159^3,4,5. TOC159 es fundamental para la biogénesis de los cloroplastos y la acumulación masiva de proteínas asociadas a fotosíntesis⁶de media. El TIC complejo consiste en el canal proteína-que conduce TIC20 así como TIC110 y TIC40^7,8. Recientemente, un desplazamiento de la proteína 1MD complejo en la membrana sobre interno fue aislado y contiene componentes previamente no identificado⁹, uno de los cuales fue TIC56. Recientemente aislamos Co TIC56 del complejo utilizando el protocolo de purificación de afinidad TOC159 grifo 1 MDa. Los datos indicaron una superposición estructural entre los complejos TOC, TIC "canónicos" y el complejo de MDa 1¹⁰. Previamente desconocidos componentes como KOC1 también fueron identificados como nuevos socios de la interacción de los complejos TOC y TIC usando el método TAP se ha descrito aquí de^10,11.

Así, la purificación de grifo-tag es un método eficiente para el aislamiento de complejos de la proteína y la identificación de socios interactúan por posteriores análisis de espectrometría de masa¹². La etiqueta TAP consiste en dos repeticiones de atascamiento de IgG separadas de un péptido de unión a calmodulina (CBP) por un tabaco etch sitio de la hendidura de proteasa de virus (TEV). El método original, que consiste en un paso de purificación de la afinidad de la IgG seguida por escote TEV y cromatografía de afinidad de calmodulina posterior permite la purificación natural de complejos de proteínas grandes y altamente puro^13,14 . Hemos simplificado el procedimiento y demostraron que los complejos de proteínas que contiene el TOC159 se pueden también purificar eficientemente usar sólo la afinidad de IgG purificación paso seguido por TEV-escote para elución¹⁵. En nuestra experiencia, la omisión del paso de afinidad de calmodulina resultaron en mayores rendimientos y por lo tanto puede ser apropiada para las proteínas de baja abundancia.

En definitiva, nos ingeniería transgénica estable a. thaliana líneas expresando TOC159 grifo de ppi2 (toc159 KO mutante) de fondo y establecido como una fuente confiable para la purificación de complejos de TIC TOC. El protocolo para el aislamiento del complejo TIC TOC comienza con la homogeneización del material vegetal en solución tampón libre de detergente. Después de la centrifugación, el sobrenadante se descarta. El precipitado que contiene la fracción de membrana total es solubilizado mediante un búfer que contiene el detergente. Después de un paso de la ultra centrifugación, el sobrenadante que contiene complejos solubles de TIC TOC se aplica a la resina de IgG para la purificación de la afinidad. Después de varios pasos de lavado, elución se lleva a cabo utilizando un búfer que contiene la proteasa TEV hender selectivamente aguas abajo de los dominios de unión de IgG y suavemente suelte nativos complejos que contienen TOC159. El efluente de la TEV puede ser analizado directamente por Western blotting o espectrometría de masas para identificar a los socios de la interacción de TOC159^10,11,15. El método también se ha utilizado para identificar las modificaciones post-traduccionales de TOC159¹⁵. En el futuro, nativo que contiene la TOC159 complejos pueden usarse para estudios estructurales usando microscopia del cryoelectron.

Protocolo

1. preparación de las plantas de Arabidopsis

1. Preparar 1 L de medio fuerza de vitaminas incluya medio Murashige y Skoog (MS) con 1% de sacarosa y ajustar el pH a 5.7 con hidróxido de potasio (KOH). Agregar 0,8% del phytoagar y autoclave durante 20 min a 120 ° C.
2. Poner 75 mL de medio MS por placa de Petri (diámetro 14,5 cm, alto 3 cm) y permitir la solidificación durante 1 hora.
3. Añadir 30 mg de semillas de Arabidopsis thaliana a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y superficie esterilizar con etanol al 70% (v/v) que contiene 0,05% (v/v) Triton X-100 durante 5 minutos, seguido por 100% etanol (v/v) durante 10 minutos eliminar el etanol.
4. Transferir las semillas a papel de filtro estéril para el secado. Espolvorear las semillas esterilizadas uniformemente sobre una placa de MS (cada genotipo requiere placas de al menos 8-10) y sello de cada placa con cinta quirúrgica.
5. Incubar las placas a 4 ° C durante dos días en la oscuridad para sincronizar la germinación de la semilla. Traslado a una cámara de crecimiento con el siguiente ciclo de luz: 8 h de 120 μmol m⁻² s⁻¹ luz y 16 h de oscuridad a 22-20 ° C.

2. preparación de perlas de agarosa HsIgG

1. Suspender cuentas de agarosa CNBr-activado (4 g) en 100 mL de ácido clorhídrico de 1 mM e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
2. Transferencia de las perlas de agarosa a un filtro de vidrio sinterizado, la colada bajo vacío con 100 mL de ácido clorhídrico de 100 mM y repita 2 - 3 veces.
   Nota: Preenfriar la solución de lavado a 4 ° C.
3. Resuspender las perlas de agarosa en 1 mL de frío 100 mM HCl y transfiéralo a un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Lavar el filtro de vidrio sinterizado con 3 mL de ácido clorhídrico de 100 mM y transferir el líquido al mismo tubo.
4. Gira a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante con una pipeta.
   Nota: No decantar el tubo.
5. Resuspender los granos en 50 mL de tampón de unión (tabla 1); Mezclar brevemente y luego vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
6. Disolver 50 mg de liofilizado Homo sapiens IgG (Hs-IgG) en 10 mL de tampón de Unión, mezcle suavemente las perlas de agarosa e incubar en agitador rotatorio durante la noche a 4 ° C.
7. Gira a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante con una pipeta.
8. Lavar las perlas de agarosa IgG con 50 mL de acoplamiento de buffer y vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
9. Resuspender las perlas de agarosa IgG con 50 mL de solución amortiguadora de bloqueo (tabla 1) y vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Repetir una vez.
10. Suspender cuentas de IgG-agarosa en 50 mL de solución amortiguadora de bloqueo, gire la mezcla por 2 h a temperatura ambiente y vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
11. Quite el sobrenadante y resuspender las perlas de agarosa IgG en 200 mL de tampón de unión de NaCl (tabla 1).
12. Para bloquear cualquier grupos restantes de CNBr Cross-linking, lavar las perlas de agarosa IgG con 100 mL de HCl de 0,1 M glicina-pH 2.8. Gira a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Lavar con 0.2 M glicina-HCl, pH 2.8, centrifugado a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Por último, lavar las perlas de agarosa IgG con 200 mL de agua ultrapura.
13. Lavar las perlas de agarosa IgG con 200 mL de agua ultrapura y luego 200 mL de tampón PBS (tabla 1).
14. Suspender las perlas de agarosa IgG en 20 mL de tampón PBS con 0,01% NaN₃ (sódica) y almacenar a 4 ° C.

3. aislamiento y solubilización de la fracción de membrana

1. Moler 10 g de plántulas de a. thaliana de tres semanas en nitrógeno líquido con un frío mortero y una maja de la arena.
2. Añadir 20 mL de pulido buffer (tabla 1) a 10 g de tejido de tierra fría, mezcla bien y descongela el hielo.
3. Filtrar el homogeneizado a través de dos capas de material de la filtración rápida en un tubo de centrífuga cónico de 50mL. Empapar el material de filtración rápida con el buffer antes de filtración de pulido.
4. Centrifugar el filtrado durante 10 minutos a 1.500 × g a 4 ° C y transferencia el sobrenadante a un tubo de centrífuga cónico de 50 mL enfriado, repita el mismo paso una vez más y recoger el sobrenadante. Retener un 200 μL de muestra de la "fracción total" y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis
5. Transferir el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga mL 38,50 fría y superior a 35 mL con tampón frío de pulido. Centrifugar por 1 h a 100.000 × g a 4 ° C en una ultracentrífuga.
6. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Retener un 200 μL de muestra de la "fracción soluble" y tienda a-80 ° C para su posterior análisis.
7. Resuspenda el precipitado verde utilizando un homogenizador de vidrio teflon, en tampón de pulir. Centrifugar durante 1 h a 100.000 x g a 4 ° C en una ultracentrífuga y descarte el sobrenadante.
8. Resuspender el precipitado verde en 18,75 mL de 1 x de Buffer utilizando un homogeneizador de vidrio teflon de pulido y añadir 9,375 mL de 1 x de tampón de pulir.
9. Añadir 9,375 mL de solución de x solubilisation 4 (tabla 1) (contiene el TX-100 detergente) para dar 37,5 mL e incubar por 30 min en un "agitador rotativo" a 4 ° C.
10. Centrifugar por 1 h a 100.000 × g a 4 ° C en una ultracentrífuga. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Conservar una muestra de 200 μL del sobrenadante (futuro "fracción de la carga") y tienda a-80 ° C para su posterior análisis.
11. Resuspender el precipitado en 37,5 mL de tampón de pulir. Conservar la muestra de la parte insoluble y conservar a-80 ° C

4. inmunoprecipitación

1. Equilibrar 100 μl de la resina de IgG-agarosa embalada en tampón A (tabla 1) y vuelta a 100 × g durante 5 min a 4 ° C.
2. Quite el sobrenadante y resuspender el IgG-agarosa resina en 100 μl de Buffer A 4 ° c.
3. Transferencia de la resina lavada de IgG-agarosa al 37,5 mL de membranas solubilizadas e incubar durante una noche en un agitador rotatorio en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL a 4 ° C.
4. Sedimento la IgG-agarosa resina en 100 × g por 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante con una pipeta. Retener un 200 μL de muestra del "flujo a través" y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis.
5. Lavar la resina IgG-agarosa en 37,5 mL de tampón A e incubar por 10 min en un agitador rotatorio.
6. Sedimento la IgG-agarosa resina en 100 × g por 5 min a 4 ° C, retirar el sobrenadante con una pipeta, añadir 5 mL del Buffer A un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 100 × g, 4 ° C, 5 minutos retener un 200 μL de muestra de la "colada de 1" y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis.
7. Repetir 5 mL lavado paso tres veces con Buffer A.
8. Llevar a cabo los dos últimos pasos de lavado sin los inhibidores (NaF, inhibidor de la proteasa y PMSF)
   Nota: Inhibidores ya no son necesarios en esta etapa y se omite para reducir los costos. Conservar una muestra de 200 μL de la última lavadora paso "lavado final (W6)" y tienda a-80 ° C para su posterior análisis.
9. Transferencia de la resina de IgG-agarosa a una columna de centrifugado 500 μl con 35 μm filtro y lave los granos dos veces con 300 μL de tampón de elución de TEV (tabla 1) (no contiene AcTEV) para conseguir el equilibrio. Cerca de la columna de vuelta.
10. Añadir 300 μL de tampón de elución de TEV que contiene 50 unidades (10 μl) de AcTEV. Preparar la mezcla en un tubo antes de agregar a la resina.
11. Incubar la columna de vuelta con los granos en un Termomezcladores a 16 º C, 350 r.p.m. durante 2 h. invertir la columna suavemente varias veces cada 30 minutos.
12. Abrir la columna de giro, colocarlo en un tubo limpio de 1.5 mL nuevo y vuelta a 100 × g por 5 min a 4 ° C para recoger el eluido.
13. 10% (v/v) de la muestra eluída (~ 25 μl) en un evaporador centrífugo en seco (por ejemplo) y usar para espectrometría de masas u otros análisis más.
14. Alícuota del efluente restante (~ 275 μL) divididas en once centrífuga de 1,5 mL tubos (25 μl cada una), seco en un evaporador centrífugo y almacenar a-80 ° C.
15. Analizar las muestras retenidas durante todo el procedimiento, así como los eluatos por estándar SDS-PAGE seguido immunoblotting. Para preparación de muestras, precipitado 50 μg de Total (T), carga (L), flujo (FT), lavar 1 (W1) y 200 μL de lavado 6 (W6) por Cloroformo/metanol extracción¹⁶.
16. Añadir 10 μl de 2 x de tampón de carga SDS-PAGE (tabla 1) las muestras precipitadas y 25 μl de la muestra seca eluída. Mezclar y hervir durante 10 minutos a 95 ° C en un bloque de calor.
17. Analizar la carga (L), flujo (FT), Total (T), lavado 1 (W1), lavar 6 (W6) y elución (E) immunoblotting usando anticuerpos anti-TOC159 para determinar la eficacia del procedimiento de aislamiento.

Resultados

Aquí se describe un protocolo para la purificación de una proteína de envoltura de cloroplasto de TAP-con la etiqueta compleja de transgénicos a. thaliana plantas. Como se muestra en la figura 1A, plantas expresando el 35S:NTAP-TOC159 de construcción fueron utilizados para aislar este complejo mientras que plantas que expresan la construcción de 35S:NTAP fueron utilizadas como control. Figura 1 B muestra pasos detallados de la purificación de complejos de proteínas TAP-TOC159 seguida de espectrometría de masas para permitir la identificación de proteínas interactuantes. El análisis de immunoblot (figura 2, derecha) confirma que TAP-TOC159 aislados interacciona con TOC75 y TOC33 del complejo TOC. La kinasa de membrana externa de cloroplasto KOC1 sabido que fosforilan TOC159 también aislada conjuntamente con el complejo de grifo-TOC159 (figura 2B, lado derecho). La presencia de TIC110 revela que el complejo TOC159 grifo aislado contiene los componentes del complejo TIC. El FBN1A anticuerpos contra una proteína de plastoglobule sin relación a la importación de proteínas no reconoció el complejo de grifo-TOC159 indicando la ausencia de contaminaciones. En el control negativo, proteína NTAP immunoprecipitated no aislar conjuntamente con cualquiera de las proteínas de TIC TOC (figura 2, izquierda) y confirma la especificidad de la purificación de grifo-TOC159.

Figura 1 . Esquema de las construcciones y el procedimiento de purificación afinidad. (A). el 35S:NTAP-TOC159 construcción, codificación de NTAP TOC159 fue estable expresado en Arabidopsis thaliana. Las plantas control negativo expresan el constructo 35S:NTAP, codificación de la etiqueta de TAP solo. (B). el protocolo de purificación paso sabio afinidad consiste en membrana aislamiento y solubilización, IgG agarosa inmuno-purificación, lavado, escote de proteasa TEV y elución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Purificación de la afinidad del tándem de la proteína de TOC159. N-terminal TAP-con la etiqueta TOC159 se purificó de NTAP TOC15: plantas deArabidopsis ppi2 y grifo proteína purificada a partir de plantas TAP: WT fue utilizada como control negativo. Total proteína solubilizados los extractos (T), proteínas de la membrana = fracción de la carga (L), flujo (FT), primero y por último lavar fracciones (W1 y W6) y el 10% de la elución TEV se analizaron por Western blot. La membrana fue sondada con los anticuerpos contra TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) y FBN1A (AT4G04020). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla de buffers
Tampón de Unión	NaHCO3 Ajustar a pH 8.5 ajustar el pH con 0,1 M de Na2CO3	100 mM
Tampón de bloqueo	Tris-HCl Ajustar pH a 8 con HCl.	100 mM
Tampón PBS	Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Ajustar el pH a 7.3 con ácido clorhídrico.	4,3 mM 1.4 mM 137 2.7
Tampón de unión de NaCl	Tampón de Unión NaCl	1 M
2 x de Buffer de pulido	Tris-HCl, pH 7.5 con ácido clorhídrico. NaCl NaF PMSF Cóctel de inhibidor de proteasa vegetal	100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0.20%
4 x solución de solubilización	Glicerol Triton-X100	40% 3%
Buffer A	2 x de Buffer de pulido 1 x Buffer de pulido 4 x solución de solubilización	100 ml 50 ml 25 ml 25%
Elución de TEV Buffer	Tris-HCl, pH 8 con HCl EDTA, pH 8 con HCl NaCl Glicerol Triton-X100 TDT	50 mM 0,5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM
2 x carga de SDS-PAGE del almacenador intermediario	Tris-HCl pH 6.8 con HCl SDS Glicerol Azul de bromofenol TDT	0.1 M 4% 20% 0.20% 0.2 M

Tabla 1. Recetas del almacenador intermediario.

Discusión

Hemos demostrado que un solo paso de purificación de etiqueta TAP es un método específico y eficiente para la purificación del complejo de TIC TOC de Arabidopsis . Aunque la etiqueta de llave permite dos pasos sucesivos de la purificación (IgG-seguido por la purificación de afinidad de calmodulina después de TEV proteasa-escote), creemos que en muchos casos el primer paso de afinidad seguido de escote de proteasa TEV serán suficiente. Nuestro objetivo, TOC159, es poco abundante y la inclusión de la segunda etapa de afinidad de calmodulina excesivamente disminuida la producción de proteína que fue la razón principal de excluir de nuestro presente Protocolo. La elución de TEV en sí mismo es un paso de purificación altamente específicos y suave que sólo dará a conocer el objetivo de TAP-con la etiqueta junto con socios de interacción asociada mientras que las proteínas no específicamente a la resina de IgG contaminantes seguirá allí. Así, en combinación con el paso de la afinidad de la IgG, la elución de TEV resulta en una purificación suficientemente eficiente para los nuestros y probablemente muchos otros propósitos.

Debe tenerse cuidado que la construcción de TAP-con la etiqueta es completamente funcional en vivo. Etiquetado grifo podría tener efectos potencialmente deletéreos sobre la actividad de la proteína, estabilidad o localización. TOC159 consiste en tres dominios, el dominio acídico N-terminal, el dominio central de unión a GTP y dominio de membrana C-terminal, que ancla la TOC159 en la membrana externa cloroplasto del². Para evitar posibles interferencias con la inserción de la membrana, fundió el grifo-tag para el N-terminal de TOC159. Fusión a la N-terminal es más bien la excepción que la regla. Muchas proteínas contienen información dirigida a N-terminal y por lo tanto deben por etiquetadas en el C-terminal. Nos aseguró que TOC159 es funcional en vivo por la complementación de la mutante de ppi2 (un mutante albino falta TOC159) con llave-TOC159. El rescate de la verde, fenotipo tipo silvestre indicó que TAP-TOC159 funcional¹⁵.

El protocolo de purificación se utiliza para identificar a nuevos socios de la interacción de TOC159, que incluye KOC1 y TIC56^10,11. En total, alrededor de 30 proteínas se asociaron con el complejo sugiriendo esa interacción nuevos socios serán aislados y caracterizados en un futuro cercano. Mientras que es muy recomendable el grifo-tag para la purificación del complejo, todavía queremos que versiones adicionales a la que aquí se presenta existen y pueden ser muy útiles para algunas aplicaciones.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaHCO3	PanReac  AppliChem	A0384
Tris	Biosolve	0020092391BS
Na2HPO4	Sigma	S7909
KH2PO4	PanReac  AppliChem	A2946
NaCl	PanReac  AppliChem	A2942
NaF	Sigma	S1509
PMSF	PanReac  AppliChem	A0999	Cóctel de
inhibidores de proteasa vegetales	tóxicos Sigma	P9599
Glicerol	PanReac  AppliChem	A0970
Triton X100	Roche	10789704001
Glycine	PanReac  AppliChem	A1067
EDTA	Carl Roth	8043
Ditiotreitol (DTT)	PanReac  AppliChem	A1101
SDS	PanReac  AppliChem	A0675
Azul de bromofenol	Sigma	B0126
HCl	VWR	20252-290	Sacarosa corrosiva
	PanReac  AppliChem	A3935
Medio Murashige y Skoog con vitaminas	Duchefa Biochemie	M0222
Phytoagar	Duchefa Biochemie	P1003
Placa de Petri	Greiner Bio-one	639102
tubos de microfuga de 1,5 mL Sarstedt		72.706
Etanol	Fisher químico	E/0600DF/15
Papel de filtro	Whatman	10311804
Cinta quirúrgica	3M	1530-1
CNBr-Perlas de agarosa activadas (sefarosa 4B)	GE Healthcare	17-0430-01
Filtro de vidrio sinterizado	DURAN	2515703
Tubo de centrífuga 50 mL	TPP	91050
Inmunoglobulina G purificada (HsIgG)	MP Biomedicals	855908
Agitador giratorio	IKA	4016000
NaN3 (azida sódica)	Sigma	71290	Tóxico
Material de filtración rápida (Miracloth)	Merk-Millipore	475855
Ultracentrífuga XNP-80	Beckman Coulter	A99839
Rotor SW 32 Ti	Beckman Coulter	369650
Tubos ultracentrífugos	Beckman Coulter	326823
Homogeneizador de teflón de vidrio (Potter)	Wheaton	357426
Columna de centrifugado (Mobicol)	Mo Bi Tec	M1003
Filter 35µ m para columna de centrifugación (Mobicol)	Mo Bi Tec	M513515
AcTEV	Invitrogen	12575-015
Evaporador centrífugo (Speed Vac)	Eppendorf	5305000100
anticuerpo FBN1A(PGL35)	AgriSera	AS06 116	RRID:AB_2247012
Sand, Fontainebleau	VWR	27460.295