Aquí presentamos un protocolo para murino en vivo etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular con biotina. Este protocolo contiene información sobre la perfusión de los riñones de ratón, aislar glomérulos y realizar endógena inmunoprecipitación de la proteína de interés.
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Artículo de método
Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular
En este artículo
Resumen
Resumen
Proteinuria resulta de la alteración del filtro glomerular que está conformada por el endotelio fenestrado, la membrana basal glomerular y podocytes con sus diafragmas de abertura. La delicada estructura del filtro glomerular, especialmente el diafragma de la raja, se basa en la interacción de proteínas de superficie de diversas células. Estudio de estas proteínas de superficie celular hasta el momento se ha limitado a estudios en vitro o análisis histologic. Aquí, presentamos un murino en vivo Biotinilación etiquetado método, que permite el estudio de las proteínas de superficie celular glomerular bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Este protocolo contiene información sobre la perfusión de los riñones de ratón, aislar glomérulos y realizar endógena inmunoprecipitación de la proteína de interés. Semi-cuantificación de la abundancia de superficie celular glomerular está disponible con este nuevo método y todas las proteínas accesibles a perfusión de biotina e inmunoprecipitación puede estudiarse. Además, aislamiento de glomérulos con o sin Biotinilación permite más análisis de RNA glomerular y proteínas así como glomerular primaria de la célula cultura (es decir, Podocito primario de la célula).
Introducción
Proteinuria es un sello de lesión glomerular y generalmente acompaña alteración del filtro glomerular1. El filtro glomerular está compuesto por el endotelio fenestrado, la membrana basal glomerular y podocytes. La delicada estructura molecular del filtro glomerular es altamente dinámico y sujeto a la proteína de la superficie de la célula trata de ambos riñones sano y enfermo2,3,4,5,6 . Endocitosis de proteínas de la superficie de la célula se ha demostrado para ser esencial para la ....
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Protocolo
Se obtuvieron ratones como una raza propia de las instalaciones de cuidado de los animales locales o de los laboratorios de Janvier en Francia. Las investigaciones se llevaron a cabo según las directrices descritas en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (US nacional institutos de salud publicación no. 85-23, revisada en 1996). Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las pertinentes aprobaciones institucionales (Gobierno del estado LANUV referencia número AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. preparación de equipos, instrumentos y soluciones
- Preparar 1 L de solución salina amortiguada de fosfatos con....
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Resultados
Para aislar glomérulos con precisión, es necesario inundar murinos riñones con PBSCM primero. Perfusión con PBSCM activa riñones pálidos (figura 1A). Embolización de glomérulos con bolas magnéticas serán visible como puntos marrones en la superficie del riñón (figura 1B). Aislamiento de glomérulos con el colector de imán puede mostrar contaminación con tubuli renal (figura 1<.......
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Discusión
El método presentado permite aislamiento exitoso de glomérulos investigar glomerular ARN o proteína. Además, pueden realizarse cultivos de células glomerulares primarios de los glomérulos aislados. Si la biotina se aplica antes de aislamiento glomerular, etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular se puede realizar. Con este método, se puede estudiar en vivo células glomerulares trata de proteína de la superficie, y semi-cuantificación de la abundancia de la proteína es posible. Los pasos más crí.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Blanka Duvnjak para su asistencia técnica excepcional. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 a M.W. y QU280/3-1 al coeficiente intelectual La donante no tenía ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos, análisis de datos, publicación y preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Motic SMZ168 BL | Microscopio | de SMZ168BL | Motic |
| con ratones KL1500LCD | Microscopía de Pulch y Lorenz | 150500 | luz para cirugía con ratones |
| Rompun (xilacina) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anestesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | tijeras finas, para corte en la aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | para corte abdominal |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | para cirugía hasta que se abra el abdomen |
| Prä parierklemme | Aesculap | BJ008R | para cirugía |
| Seraflex | Serag Wiessner IC108000 | seda | |
| Ketamina 10% | Anestesia | Medistar | |
| Rompun (xilacina) 2% | Anestesia | Bayer | |
| Tubo de polietileno de diámetro interior fino 0,28 mm de diámetro exterior 0,61 mm | Catéter Portex | 800/100/100 | |
| Diámetro interior del tubo de polietileno de diámetro fino 0,58 mm de diámetro exterior 0,96 mm | Catéter Portex | 800/100/200 | |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | bomba de jeringa |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotina |
| Dynabeads Células T de ratón intactas | Invitrogen | 11413D | para embolizar glomérulos |
| Colagenasa A | Roche | 10103578001 | para digerir el tejido renal |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Recogedor de imanes |
| 100µ tinción de células m | Greiner-bio | 542000 | para aislamiento glomerular |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | no disponible | para confirmar la pureza glomerular |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Homogeneizador |
| de tejidos CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | para tampón de lisis |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | para tampón |
| NaCl | Productos químicos VWR | 27810295 | para tampón de lisis |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | para tampón de lisis |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | para tampón de lisis |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | para tampón de lisis |
| Pierce BCA kit de ensayo de proteínas Thermo | Scientific | 23225 | Siga las instrucciones del fabricante |
| anticuerpo de nefrina | Progen | GP-N2 | para westernblot |
| Anticuerpo policlonal anti-podocalixina | de cabra R& D Systems | AF15556-SP | para westernblot |
| Estreptavidina Resina de agarosa | Thermo Scientific | 20347 | para inmunoprecipitación |
| Proteína A sefarosa CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | para inmunoprecipitación |
| anticuerpo policlonal anti-p57 de conejo | SCBT | sc-8298 | para inmunohistoquímica |
| anticuerpo monoclonal de ratón anti-beta actina, clon AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | blot |
| conejo anti-p44/42 | señalización celular | 4695 | para westernblot |
| Pierce Estreptavidina-HRP de alta sensibilidad | Thermo Scientific | 21130 | para westernblot |
| ratón policlonal anticuerpo ICAM-2 | R& D Systems | AF774 | para |
| ratón policlonal westernblot anti-VE-cadherin | R& D Systems | AF1002 | para westernblot |
Referencias
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin en....
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Reimpresiones y permisos
