Un electrodo Micro-agar sal puente para el análisis de la tasa de rotación de protones de las proteínas recombinantes de la membrana

Resumen

En las mediciones electrofisiológicas, la presencia de un potencial de difusión perturba la medida exacta del potencial inversa alterando el potencial de electrodo. Usando un puente de sal micro-agar, se minimiza el impacto de la difusión potencial, que permite una medición más precisa de los números de facturación de sustrato de proteínas de membrana recombinantes reconstituido.

Resumen

Hasta la fecha, más del 50% de todas las drogas farmacológicas apuntan a la cinética del transporte de proteínas de membrana. La caracterización electrofisiológica de las proteínas carrier de la membrana reconstituido en las membranas de bicapa lipídica es un método potente pero delicado para la evaluación de sus propiedades físico-químicas y farmacológicas. El número de volumen de sustrato es un parámetro único que permite la comparación de la actividad de proteínas de membrana diferentes. En un transporte de electrógenos, el gradiente del sustrato translocado crea un potencial de membrana que se corresponde directamente con la tasa de rotación del substrato de la proteína. Utilizando electrodos de cloruro de plata, se induce un potencial de difusión, también llamado a ensambladura líquida potencial, que altera el potencial de electrodo y perturba significativamente medidas potenciales de membrana precisa. Potencial de difusión puede ser minimizada por un puente de sal, que equilibra el potencial de electrodo. En este artículo, un puente de sal agar micro está diseñado para mejorar la configuración electrofisiológica, que utiliza Micropipetas para la formación de la membrana. La solución salina se introduce en una punta de pipeta microcapillary, estabilizada por la adición de agarosa y se puede montar fácilmente a un electrodo estándar. El potencial de electrodo de un electrodo micro-sal puente es más estable en comparación con un electrodo estándar. La implementación de este sistema estabiliza el potencial de electrodo y permite mediciones más precisas del potencial de membrana generado por un gradiente de pH. Mediante este sistema, las tasas de rotación de protones de los portadores mitocondriales UCP1 y UCP3 son sometidas y en comparación con las mediciones anteriores.

Introducción

Proteínas de membrana están dirigidas por hasta el 60% de todos los fármacos conocidos¹. Medidas electrofisiológicas de proteínas de membrana son una herramienta potente pero delicada para analizar el transporte electrógenos de sustratos mediada por proteínas transportadoras de membrana. La modulación de la corriente transmembrana mediante la aplicación de voltaje constante o rampas de tensión permite estimar las propiedades farmacológicas y físicas de los portadores, por ejemplo, la activación y la inhibición por sustratos o el transporte cinética. De especial interés es el número de volumen de sustrato, que muestra la cantidad de sustrato que se desplaza por una proteína de membrana por unidad de tiempo. Es un parámetro importante cuando se comparó la cinética de varias proteínas de la membrana. Establecimiento de un gradiente de la concentración del sustrato cargado a través de la membrana genera una fuerza electromotriz de la cual se deduce el número de volumen del sustrato.

Usando un electrodo de AgCl, la presencia de un buffer de cloruro-libre crea un potencial de difusión que altera el potencial de electrodo y lleva a un cambio en las mediciones de voltaje de corriente². Aunque siempre presente, es insignificante para medidas de capacidad y conductancia estándar ya que estos parámetros son dependientes de la pendiente de la grabación de corriente-voltaje (conductancia) o son la diferencia de una sola grabación (capacidad), que cancela el potencial. Sin embargo, la grabación del potencial inverso, que es creado por el transporte de sustrato, puede ser significativamente perturbada por la difusión potencial. Así, para medidas exactas del potencial inverso, los potenciales de electrodo tienen que mantenerse constante.

El potencial de difusión puede ser minimizada mediante dos métodos: (i) en presencia de una membrana bicapa, una concentración de sustrato tiene que ser aumentado en un lado de la membrana^3,4, o (ii) un puente de sal equilibra el potencial de electrodo ⁵. el primer método es altamente dependiente de la estabilidad de las mediciones. La membrana tiene que sobrevivir durante varios minutos, de la adición del substrato, bajo agitación hasta que el sustrato se distribuye casi por igual en la solución. Si la membrana se rompe en el medio, el gradiente de sustrato es alterado por el libre intercambio de moléculas cargadas y mediciones a la inexactas. El último método equilibra la difusión potencial pero está limitado por el tamaño de la instalación. Implementación de un pequeño pero funcionamiento puente de sal en una gama de micro a una configuración electrofisiológico es difícil⁶. Para este último método, la solución de sal se llena en una punta de microcapillary y estabilizada por la adición de agarosa para evitar la difusión de la solución de sal en la solución tampón.

En este protocolo, se describe una sencilla producción de un micro-agar sal puente e implementación en una configuración electrofisiológica basada en la pipeta puesta a punto⁷ . Una punta de microcapillary se ajusta contienen una solución de KCl de 3 M con agarosa de 1 mol % (w/v) y una solución de AgCl electrodo y buffer del puente. La ventaja del puente micro-sal se muestra grabaciones de tiempo de la cambio de potencial de electrodo y las más precisas mediciones de potencial en diferentes gradientes de pH de membrana. En el sistema modelo de proteínas recombinantes reconstituida en liposomas, las tarifas de facturación de mitocondriales portadores UCP1 y UCP3 producidos bajo condiciones similares están sometidas y en comparación con anteriores resultados^3,8.

Protocolo

1. producción de proteínas recombinantes desacoplar (UCPs) y la formación de las membranas de bicapa Planar

1. Producir recombinantes UCP1 y UCP3 descrito por Rupprecht et al. ⁹ y Hilse et al. ¹⁰
2. Forman las membranas de bicapa planar en las puntas de pipetas de plástico prescindibles convencionales según lo descrito por Beck et al. ⁷

2. preparación del electrodo Micro-agar sal puente

1. Ajustar una pipeta microcapillary punta (véase Tabla de materiales) a la longitud adecuada.
   1. Marque la posición en una punta vacía en la que la punta que contiene el buffer se unirá a y utilizar un calibrador deslizante para medir la longitud del electrodo micro-agar sal puente.
      PRECAUCIÓN: La punta de microcapillary debe ser lo suficientemente larga para entrar en la solución tampón para las mediciones.
   2. Cortar la punta de microcapillary con un cuchillo afilado o una cuchilla y limpiar la superficie de corte con agua y etanol.
2. Prepare el electrodo revestido de AgCl.
   1. Cortar un alambre de Ag de aproximadamente 8 cm de longitud y limpie con agua y etanol.
   2. Tome un pedazo de papel de lija y alisa la superficie de 1 cm de longitud en el extremo del cable, que debe estar en contacto con la solución de sal.
   3. El alisado final de la inmersión en una solución de KCl de 3 M y capa electroquímicamente con cloro utilizando una fuente de 1.5 V para 10 s.
   4. Limpiar el electrodo con agua, secarlo y ajustar la longitud del AgCl electrodo desde el lado no recubierto de modo que penetre la punta microcapillary tan profundamente como sea posible.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.
3. Preparar una solución salina de KCl de 3 M con agarosa al 1% (v/v).
   1. Pesar 4,47 g de KCl y disolver en 20 mL de agua agitando en un matraz.
   2. Quitar el agitador, pesar 0,2 g de agarosa y añadir al matraz.
   3. Calentar la solución a 100 ° C para fundir la agarosa y evitar que se coagule.
      PRECAUCIÓN: El matraz estará muy caliente. No toque con las manos desnudas. Utilice guantes para la manipulación.
4. Llenar la punta de microcapillary con la solución de sal de agarosa.
   PRECAUCIÓN: La solución es caliente. Proteja sus manos y trabajo con cuidado para evitar salpicaduras.
   1. Si la agarosa inicia la coagulación, calentar la solución de sal totalmente derretir la agarosa otra vez.
   2. Tomar 10 μl de la solución de sal de agar en la punta de microcapillary. Sumerja lentamente y con cuidado evitar aire burbujas en la punta.
   3. Retire la punta de la pipeta y empuje en el AgCl electrodo desde el lado más amplio de la punta. Asegúrese de que el electrodo penetra en la solución de sal.
   4. Enfriar el electrodo a la temperatura ambiente y enchúfelo en el amplificador.
5. Preparar el tampón para las mediciones.
   1. Pesar 0,710 g de Na₂SO₄, 0,195 g de MES, 0,121 g de TRIS, 0,023 g de EGTA, añadir 100 mL de agua destilada a un vaso de precipitados y agitar la solución.
   2. Revise el pH del buffer utilizando un electrodo de pH y ajustar el pH de 7.32.
   3. Compruebe que el electrodo de referencia y el electrodo de puente de sal agar en contacto eléctrico.
      1. Añadir 1 mL de buffer a un recipiente de plástico.
      2. Sumergir el electrodo de referencia y el electrodo de puente de sal agar y busque una respuesta de la señal. Si la respuesta de la señal es correcta, proceda al paso 2.7.
6. Si existe una respuesta de falsa señal o no hay contacto eléctrico, realizar la siguiente solución de problemas.
   1. Compruebe si el electrodo está en contacto con la solución de sal y empujar el electrodo en la solución.
      Nota: Si la solución ya está demasiado pegajosa, quitar el micro-agar sal y preparar una nueva punta de microcapillary.
   2. Compruebe si hay burbujas de aire dentro de la solución de sal. En caso afirmativo, preparar una nueva punta de microcapillary.
   3. Compruebe si la solución de sal está en contacto con la solución tampón. Si no, luego cortar otro 1 mm en el extremo del tubo de la punta.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la punta sigue siendo lo suficientemente largos para penetrar la punta que contiene el buffer. Si todavía no hay contacto, hay que preparar una nueva punta de microcapillary.
   4. Si ninguno de estos pasos ayuda, preparar una nueva punta de microcapillary.
7. Para el almacenamiento, sumergir el electrodo de puente de sal agar en una solución de KCl de 3 M.
   Nota: El protocolo se puede parar aquí. Una pausa durante la noche, guardar el electrodo en solución salina de KCl de 3 M a 4 ° C.
8. Preparar la punta de plástico que contiene el buffer.
   Nota: Si el electrodo fue almacenado durante la noche, sacarlo y dejarlo calentar hasta la temperatura ambiente durante 30 minutos.
   1. Tomar una punta de microcapillary y doblar el tubo, de 2 cm del borde de la parte estrecha, aproximadamente 90 grados usando un alambre de la calefacción.
   2. Utilizar un cuchillo muy afilado o una cuchilla y corte el tubo de alrededor de 5 mm de la curva.
   3. Limpie la superficie final con etanol y agua y mida el diámetro del orificio de la punta. De esta forma, calcular el área de la superficie.
   4. Capa de la superficie de la punta con 85:15 (v: v) hexano: hexadecano.
      1. Pipetear 3 μl de solvente y retire de la punta.
      2. Esperar 1 minuto para que se evapore todo el solvente residual en la punta.
   5. Llenar la punta de medición con 3 μl de tampón y enchufe en el electrodo de puente de sal.
      Nota: Revise de nuevo si el electrodo puente de sal y el electrodo de referencia están en contacto eléctrico realizando paso 2.5.3.
   6. Si no hay ningún contacto eléctrico, compruebe lo siguiente:
      1. Compruebe si el electrodo puente de sal está en contacto con la solución tampón. Si no, aumentar el volumen del buffer en la punta o preparar una punta más larga de microcapillary.
      2. Si hay una burbuja de aire, retire la punta del electrodo del puente de micro-sal, rellenar el búfer en la punta y conecte el electrodo nuevo.

3. medición de los parámetros eléctricos de la membrana reconstituido con proteínas recombinantes

1. Aplicar una señal de voltaje alterno triangular con máxima tensión U_max = 50 mV y ΔT_rampa = 50 ms, lo que crea una respuesta de corriente alterna rectangulares. De los valores medios de las corrientes positivas y negativas (₊ y me_–), calcular la capacidad de la membrana según la siguiente fórmula:
   
2. Aplicar una rampa de voltaje que van desde -50 mV a + 50 mV y registro de la corriente. Ajustar una función lineal a los datos - la pendiente es la conductancia - y calcular el punto de intersección del eje x del ajuste.
3. Descarga la solución en la punta de plástico y llenar uno nuevo con un tampón que contiene una concentración de sustrato mayor.
   1. Si no hay membrana se forma dentro de los primeros 20-30 s, el volumen de descarga y llénelo. Esto garantiza que el gradiente de concentración a través de la membrana no cambia significativamente durante la formación de la membrana.
   2. Después de la formación de una membrana, realice los pasos 3.1 y 3.2 para verificar la formación de la membrana adecuada y conseguir el punto de intersección del eje x.

4. cálculo de la tasa de rotación de sustrato

Nota: Ver trabajos anteriores para detalles^3,7.

1. Estimar la cantidad de proteína en la membrana de la masa molecular de lípidos y proteínas (M_lípido y_proteínade M), el área de la membrana y del grupo de cabeza de un lípido (una_membrana y un_lípido) y la relación entre la masa de la proteína por lípidos (r).
   
2. Calcular el potencial para el substrato transportado de Nernst. R es la constante de gas, T la temperatura, z la carga del sustrato transportado, F el Faraday constante y c₁ y c₂ las concentraciones del sustrato de ambos lados de la membrana.
   
3. De las grabaciones de corriente-tensión, tomar la inversa potencial calculado con la diferencia de los puntos de intersección del eje x de los ajustes lineales en presencia y en ausencia del gradiente de sustrato.
4. Para calcular la proporción de conductancia de sustrato, G de_substrato, a la conductancia de membrana total, G_total, la proporción de inversión potencial de potencial de Nernst¹¹.
   
5. Calcular la ΔN número de volumen de sustrato_sustrato por tiempo ΔT de unidad de la conductancia de sustrato (_sustratode la G), la tensión U y la carga de la z: del substrato
   
6. La relación de sustratos transportados por tiempo a la cantidad de proteínas, calcular el volumen de negocios índice κ.
   

Resultados

Para verificar la minimización de los potenciales de difusión, se midió la estabilidad de las mediciones de corriente-voltaje de una membrana intacta. En la figura 2A, grabaciones de representante corriente tensión se representan en la presencia (puntos blancos) y ausencia (puntos negros) de un gradiente de pH. Según la ecuación de Nernst, el gradiente de pH induce un cambio en el voltaje. Desde el punto de intersección del eje x de un ajuste lineal a los datos, se calcula el potencial cambio. Para probar ambos electrodos, se analizó el cambio en el punto de intersección del eje x para un electrodo estándar de AgCl (figura 2B, puntos blancos) y un puente de sal micro-agar (figura 2B, puntos negros). Una rampa de tensión se registró diez veces en una fila y el cambio promedio en el eje x se representa contra el tiempo. Mientras que el electrodo de puente de sal agar tenía un desplazamiento máximo de menos de 5 MT incluso después de 300 segundos de medición, el electrodo estándar varía hasta 30 mV de comportamiento impredecible, al azar,.

A continuación, ambos electrodos probaron a gradientes de pH diferentes (figura 3A). Para el electrodo estándar, se genera un gradiente de pH de 0.35 y 1.0 (puntos blancos); para el agar sal puente electrodo, gradientes de pH de 0.35 y 0.7 1.0 (puntos negros). El cambio de potencial se analizó en tres mediciones independientes. En contraste con un gradiente de 0.35, donde el cambio medido sólo varía ligeramente, el cambio de tensión se altera significativamente en el gradiente de pH de 1.0 en ausencia de lo micro-agar sal puente. De un ajuste lineal a los datos, la pendiente de la función es 26,4 ± 2.3 mV/ΔpH para el electrodo estándar y 50,1 ± 4,6 mV/ΔpH para el electrodo micro-agar sal puente. Según la ecuación de Nernst, el potencial cambio calculado es 60,7 mV/ΔpH en T = 32 ° C.

Utilizando el micro-agar sal puente, el número de volumen de negocios de protón, κ, de la UCP1 mitocondrial y UCP3 fue medido y Comparado con mediciones anteriores (figura 3B). Similar a la figura 3A, ΔpH = 1.0 se generó y se midió el potencial reverso. La cantidad de proteína en la membrana se calculó según la fórmula proporcionada en el apartado 4 del Protocolo, con una proteína, la proporción de lípidos de 4 μg / (mg de lípido), una masa molecular de 33.000 y 750 Da para la proteína y del lípido, un área de superficie de membrana de 3.53 x 10 ^-4 cm²y un área por lípidos de 7.8 x 10^-15 cm². Los obtenidos κwas 5.56 ± 0.38 s^-1 y 4,10 ± 0,71 s^-1 para UCP1 y UCP3, respectivamente (figura 3B).

Figura 1 : La instalación electrofisiológica con el micro-agar sal puente. (A) este panel muestra un bosquejo de la configuración. La punta de microcapillary que contiene la solución de sal agar (representada en color naranja) se coloca entre el electrodo (negro) y la punta que contiene el buffer (azul). La membrana está formada en la superficie en el extremo de la punta que contiene el buffer (indicada por la flecha). (B) este panel muestra una imagen de la configuración electrofisiológica con la implementación del micro-agar sal puente. Las flechas señalan el electrodo, el puente de sal micro-agar, el electrodo de referencia y el recipiente con la solución tampón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : La comparación de un puente de sal micro-agar y un electrodo estándar de AgCl. (A) este panel muestra un voltaje de corriente representativo medida en presencia (puntos grises) y ausencia (puntos blancos) de un gradiente de pH de 1. Las líneas representan un ajuste lineal a los datos, de que la conductancia y el eje x se obtienen valores de intersección. El cambio de voltaje se evalúa por la diferencia de los valores de la intersección de ambas grabaciones. (B) este panel muestra el cambio de membrana potencial de un electrodo estándar de AgCl (puntos blancos) a un electrodo de micro-agar sal puente (puntos negros) en el tiempo. Diez medidas de voltaje de corriente fueron grabadas en una fila y el cambio de tensión media por difusión potencial se grafica contra el tiempo. En todos los experimentos, la membrana se hizo de 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL reconstituido con 15 mol % del ácido araquidónico en una concentración de 1.5 mg/mL. El búfer contiene 50 mM de Na₂SO₄, MES de 10 mM, 10 mM TRIS y 0,6 mM EGTA en pH = 7.34 y T = 32 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Número del volumen del protón de UCP1 y UCP3 calculada a partir del inversión potencial en presencia de un gradiente de pH. (A) este panel muestra el cambio en el potencial de una membrana que contiene la UCP1 de varios gradientes de pH de un electrodo estándar de AgCl (puntos blancos) y un electrodo de micro-agar sal puente (puntos negros). Las líneas representan un ajuste lineal a los datos. (B) este panel muestra el número de volumen de negocios de protón de UCP1 (primer conjunto de datos) y UCP3 (segundo conjunto de datos) calculado como la relación de cambio de tensión al potencial de Nernst según las fórmulas en la sección 4 del protocolo. El primer bar de cada conjunto representa tasas de rotación medidas con el micro-agar sal puente. La segunda barra de cada conjunto de datos representa mediciones anteriores utilizando un electrodo estándar de AgCl. Se tomaron valores de UCP1, UCP3 Urbankovaet al. ³ y Macher et al. ⁸. en todas las mediciones, la membrana se hizo de 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL reconstituido con 15 mol % AA y UCP1/UCP3. La concentración de lípidos y proteínas fue de 1,5 mg/mL y 4 μg/mg de lípido, respectivamente. El búfer contiene 50 mM de Na₂SO₄, MES de 10 mM, 10 mM TRIS y 0,6 mM EGTA en pH = 7.34 y T = 32 ° C. El pH del buffer para las medidas de gradiente fue aumentado a 7.66 8.00 y 8.33 añadiendo TRIS y fue cambiado en la pipeta que contiene la solución. Los valores son la media ± desviación estándar de tres mediciones independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La ejecución del puente sal micro-agar con el electrodo minimiza su potencial de difusión y permite mediciones más precisas del potencial de membrana generado por un gradiente de pH. En presencia de varios gradientes de pH transmembrana, el cambio potencial de ambos electrodos fue aceptable en ΔpH = 0.35 al comparar el valor teórico del potencial de equilibrio de Nernst (Φ_Nernst = 23,8 mV para ΔpH = 0.4). Sin embargo, en gradientes de pH fisiológico más, como por ejemplo en mitocondrias entre la matriz y el espacio del intermembrane, el electrodo estándar de AgCl se ha podido medir con precisión el potencial cambio en ΔpH = 1 (figura 3A). El electrodo puenteado con micro-agar sal entrega los valores que eran mucho más comparables a la teoría.

Potencial de difusión también puede ocurrir en el electrodo de referencia de AgCl si el tampón se cambia durante el experimento. Solución tampón de cloruro-libre fue utilizado en los experimentos puesto que desacoplar las proteínas fueron sugeridas para el transporte de iones cloruro, y el pH se ajustó con Tris o MES. El electrodo de potencial, en la ausencia de una importante concentración de cloruro, sobre todo depende de las impurezas de cloruro en la solución tampón. Como su composición se ha modificado durante los experimentos, simplemente resultará en un constante potencial de compensación. Sin embargo, para la medición de una absoluta diferencia de potencial entre dos electrodos, un agar simple puente de sal sistema (Ag/AgCl 3 M KCl) podría utilizarse también para el electrodo de referencia.

Un puente de sal micro-agar equilibra la difusión potencial por un equilibrio de potencial de electrodo. Para estabilizar la solución de sal, agarosa al 1% (p/v) fue agregado para evitar la mezcla de la solución de sal con la solución tampón. Los iones de sal K⁺ y Cl^– similares movilidades en líquido y equilibrar el potencial de electrodo. Para instalar correctamente el puente de la sal, la solución de sal agar tiene que ser calentados lo suficiente para llenar la punta de la microcapillary sin burbujas de aire y cubrir el electrodo de AgCl. Antes de seguir utilizándola, contacto eléctrico entre el electrodo de puente de sal y el electrodo de referencia debe revisarse. Dependiendo de la época que se utiliza el puente de la sal, la solución de sal tiene que ser suficientemente gelificada para prevenir cualquier mezcla de la solución de sal con el buffer. Esto es especialmente crítico si K⁺ o Cl^– transportistas son investigados. El puente de sal fue utilizado por un tiempo muy corto y la elución de agarosa es insignificante en este intervalo de tiempo. Una mayor concentración de agarosa de hasta un 5% o de agar (3% - 5%), le permite utilizar el puente de sal durante un largo periodo de tiempo^6,12.

Este método permite determinar la cinética del transporte de un transportador de membrana (i) con tasas de baja rotación y (ii) de proteínas mitocondriales de la membrana interna, que apenas puede ser investigado en parche estándar abrazadera configuraciones¹³. Su precisión depende principalmente de la medición potencial inversa, que precisión se redujo a una conductancia de membrana total baja y pequeños gradientes de concentración que inducen una membrana potencial por debajo del ruido de la grabación.

Usando esta configuración, se midieron los índices de volumen de negocios de UCP1 y UCP3 producidos en las mismas condiciones. Debido al gradiente de pH más alto, las tarifas obtenidas parecen ser más precisas e imperturbable por artefactos debidos al cambio de potencial de electrodo menor. Puede ser utilizado para analizar y comparar los transportadores de la membrana mitocondrial producidas bajo condiciones similares.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Puntas de microcargador	Eppendorf	5242956.003	Punta de pipeta microcapilar
Etanol 99%	AustrAlco Ö sterr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H	AAAH-5020-07025-230317
Cloruro de calio	Carl Roth GmbH + Co. Kg	6781.3
Suministro de CC	Voltcraft	V10/CPG 1940 -01
Agarosa Standard	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3810.2
Amplificador de abrazadera de parche	Heka
Tubo de muestra	Carl Roth GmbH + Co. Kg	5863.1
Na2SO4	Carl Roth GmbH + Co. Kg	8560.3
MES	Carl Roth GmbH + Co. Kg	4256.2
TRIS	Carl Roth GmbH + Co. Kg	AE15.2
EGTA	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3054.1
Hexano	Sigma-Aldrich	296090-100ML
Hexadecane	Sigma-Aldrich	296317-100ML
Alambre calefactor	Voltcraft	USPS-2250