Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.
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Artículo de método
Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos
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En este artículo
Resumen
Resumen
La inyección intratecal (IT) de virus adeno-asociado (AAV) ha atraído un considerable interés en la terapia génica del CNS en virtud de su eficacia de transducción excelente, seguridad y noninvasiveness en el SNC. Estudios anteriores han demostrado la potencia terapéutica de terapia génica AAV-entregado en trastornos neurodegenerativos por su administración. Sin embargo, se han reportado altas tasas de fracaso impredecible debido a la limitación técnica de administración de TI en pequeños animales. Aquí, hemos establecido un sistema de puntuación para indicar el grado de éxito de la punción lumbar en pequeños animales mediante la adición de clorhidrato de lidocaína 1% en la solución de la inyección. Se muestra más que el grado de debilidad transitoria después de la inyección puede predecir la eficiencia de la transducción de AAV. Por lo tanto, puede utilizarse este método de inyección de TI para optimizar los ensayos terapéuticos en modelos murinos de enfermedades del SNC que afligen a grandes regiones del SNC.
Introducción
AAV puede mediar la expresión génica a largo plazo y generalizados en la transducción del CNS con pocos efectos secundarios y por lo tanto, se ha convertido en uno de los vehículos más prometedoras para la terapia génica para el tratamiento de enfermedades del SNC incluyendo la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), Huntington enfermedad (HD), enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedades de depósito lisosomal (LSD), la enfermedad de Gaucher (GD) y neuronal ceroid lipofuscinosis ceroid (NCL)1. En la actualidad, más de 100 serotipos AAV se han aislado de los seres humanos y animales. Entre ellos, al menos 12 han sido utilizados en preclínicos y ensa....
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Protocolo
Ratones FVB/NJ fueron criados en las instalaciones de animales de laboratorio clave de Hebei Neurología. Todos los experimentos de ratón fueron aprobados por el segundo Hospital de Hebei médica Universidad Comité de ética y llevado a cabo conforme a las normas de la gerencia del animal de laboratorio promulgada por el Ministerio de ciencia y tecnología de la República Popular de China.
1. preparación de solución madre del clorhidrato de lidocaína 20%
- Pesar 2 g de clorhidrato de lidocaína. Añadir 5-6 mL de agua estéril y agitar suavemente. Aumentar el volumen a un total de 10 mL con agua estéril.
- 1.2 filtro de la solución....
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Resultados
Los ratones mostraron diferentes grados de debilidad transitoria justo después de que inyección de solución AAV en clorhidrato de lidocaína 1% debido a varios calidad de inyección intratecal. Según el sistema de puntuación grado 5 semi cuantitativo hemos establecido, hemos probado los patrones de transducción de AAV en ratones con diferentes grados de debilidad de la extremidad inducida por lidocaína (puntuación de 0, n = 2; puntuación 1, n = 1, puntuación 4, n = 4; puntuación 5, n = 3). .......
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Discusión
Técnicamente, hay varios pasos críticos durante la inyección de IT en ratones despiertos. En primer lugar, adecuado gesto y firma el control de los ratones a lo largo de toda la operación es un requisito previo para la entrega exitosa. En segundo lugar, el punto más difícil es sentir el espacio intervertebral con la punta de la aguja, ya que es necesario no introducir demasiado profundamente sin resistencia o introduzca por la fuerza bajo fuerte resistencia en el caso de herir a los animales o doblar la punta de la aguja.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una subvención de HEBEI Provincial Departamento de recursos humanos y Seguridad Social (CY201605) y una beca de la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Hebei (H2017206101), y estamos muy agradecidos al Dr. para Gao Guangping, quien proporcionó la AAV para Este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones FVB/NJ | Charles River Laboratories China | ||
| Clorhidrato de lidocaína monohidrato | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core del Centro de Terapia Génica de la Facultad de Medicina de la Universidad | ||
| 25 µ L Jeringa Hamilton/aguja 27-30 G | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | ||
| Suero de cabra | Solarbio S9070 | ||
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Conejo anti-GFP | Life tech | G10362 | Dilución 1:333 |
| El segundo anticuerpo (cabra-anti conejo) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | dilución 1:1.000 |
| REACTIVO VECTASTAIN ABC | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Kit de sustrato de peroxidasa | Vector Lab | SK-4105 | |
| Medio de montaje para fluorescencia con DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4· 2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4· 12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehído | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Portaobjetos de microscopio de adherencia | CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electromicroscopía Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Tubo de centrífuga | CORNING | 430790 | |
| 96 pocillos colector de cultivo celular | Coster | 3599 | |
| 24 pocillos colector de cultivo celular | Coster | 3524 | |
| 70% Etanol | WEN ZHI | ||
| Gasa | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm 1 |
| mL jeringa | Hong Da | ||
| Microtubos | Micropipeta plasmada | ||
| eppendorf | |||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filtro | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | ||
| Microscopio | Olympus | BX53 | |
| Micrótomo congelador | Leica | CM1520 |
Referencias
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., <....
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Reimpresiones y permisos
