Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

Resumen

Este protocolo proporciona una metodología fácil de usar basada en Fiji junto con instrucciones sencillas que explican cómo analizar de manera confiable el comportamiento de la actomiosina en células individuales y tejidos epiteliales curvos. No se requieren habilidades de programación para seguir el tutorial; todos los pasos se realizan de forma semi-interactiva utilizando la interfaz gráfica de usuario de Fiji y los plugins asociados.

Resumen

Los óvulos inmaduros de Drosophila se llaman cámaras de huevo, y su estructura se asemeja a órganos primitivos que sufren cambios morfológicos de una forma redonda a una forma elipsoides durante el desarrollo. Este proceso de desarrollo se llama oogénesis y es crucial para generar huevos maduros funcionales para asegurar la próxima generación de moscas. Por estas razones, las cámaras de huevo han servido como un modelo ideal y relevante para entender el desarrollo de órganos animales.

Se han desarrollado varios protocolos de cultivo in vitro, pero hay varias desventajas en estos protocolos. Se trata de la aplicación de varias cubiertas que ejercen una presión artificial sobre las cámaras de huevo con imágenes con el fin de inmovilizarlas y aumentar el plano de adquisición de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo analizadas. Tal enfoque puede influir negativamente en el comportamiento de la delgada maquinaria de actomiosina que genera el poder de girar las cámaras de huevo alrededor de su eje más largo.

Por lo tanto, para superar esta limitación, cultivamos las cámaras de óvulos Drosophila libremente en los medios de comunicación con el fin de analizar de forma fiable la maquinaria de actomiosin a lo largo de la circunferencia de las cámaras de óvulos. En la primera parte del protocolo, proporcionamos un manual que detalla cómo analizar la maquinaria actomiosina en un plano de adquisición limitada a escala celular local (hasta 15 células). En la segunda parte del protocolo, proporcionamos a los usuarios un nuevo complemento basado en Fiji que permite la extracción simple de una capa delgada definida de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo. A continuación, el siguiente protocolo describe cómo analizar las señales de actomiosina a la escala tisular (>50 células). Finalmente, identificamos las limitaciones de estos enfoques tanto en las escalas celulares y tisulares locales como en su posible desarrollo futuro y posibles aplicaciones.

Introducción

El desarrollo continuo de nuevas tecnologías de imagen y software con aplicaciones en las ciencias de la vida ha proporcionado un enorme impacto en la comprensión de los principios básicos de la vida. Uno de los principales desafíos es la visualización fiable de los procesos de desarrollo en combinación con sus imágenes en vivo en diversos tejidos. Los tejidos son partes de órganos y cuerpos y, como tales, la mayoría no son fácilmente accesibles para la toma de imágenes. Por lo tanto, se han desarrollado protocolos que permiten su disección y el cultivo in vitro con el fin de visualizar eventos biológicos que reflejan suficientemente la situación in vivo dentro de un ....

Protocolo

NOTA: El siguiente protocolo proporciona instrucciones sobre cómo analizar la actomiosina en la celular local y la escala tisular en las cámaras de óvulos Drosophila. El enfoque a escala local permite a los usuarios analizar el comportamiento detallado de la actomiosina en hasta 15 células por cámara de óvulos y requiere la adquisición de TLM sin antes (5-10 min) mediante el uso de imágenes de alta velocidad y un microscopio confocal invertido. Por el contrario, la escala tisular proporciona a los usuarios información de actomiosina en 50–100 células y requiere la adquisición de TLM durante un largo período de tiempo (30 min) mediante el uso ....

Resultados

Este protocolo permite a los científicos investigar el comportamiento de las redes de actomiosina en los tejidos epiteliales. Esto sólo es posible cuando un análisis detallado del comportamiento de la actomiosina a escala celular local (unas pocas células) se combina con un análisis similar a la escala tisular (muchas células). Sin embargo, los tejidos epiteliales son a menudo curvos y la extracción de una capa delgada de estos tejidos antes no era fácilmente posible, como se muestra en l.......

Discusión

Pasos críticos y solución de problemas para la disección y el cultivo de cámaras de huevo

Si se colocan demasiadas moscas en un vial pequeño, el alimento de la mosca puede volverse fangoso después de 2-3 días debido a grandes cantidades de larvas de alimentación y moscas adultas que quedan atrapadas en la comida de la mosca. En tal caso, voltear el resto de estas moscas en un nuevo vial con alimentos frescos y reducir el tamaño de su número. En particular, excluya a las hembra.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamina
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140-122	[ +] 10.000 Unidades/mL Penicilina [+] 10.000 µ g/mL de estreptomicina
Suero Fetal Bovino	Sigma	F135
Solución de insulina inactivada por calor Sigma humano		I9278
50 mL Tubos Falcon	Eppendorf
Filtro estéril Millex-GV	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Fondo de vidrio Micropocillos MatTek	Corporation	P35G-1.5-14-C Placa de	Petri de 35 mm, Micropocillo de 14 mm, Nº 1.5
Pinzas de vidrio A	. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (tinte para membrana celular)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (colorante para membrana celular)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Portaobjetos de disección por depresión	Fisher Scientific	12-560B
Equipo microscópico
Steromicroscope	. ej., Microscopio confocal invertido Zeiss		Stemi SV 6
Microscopio de disco giratorio	Zeiss/Olympus
Vidrio microscópico/cubreobjetos	, p. ej., Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/cactus
barrilDrosophila stocks utilizados en el manuscrito
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			Para más detalles, véase Rauzi et al.: Los flujos contráctiles de actomiosina polarizados planos controlan la remodelación de la unión epitelial. Nature 2010, Vol. 468, págs. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			Para más detalles, véase Viktorinova et al.: La rotación epitelial está precedida por la ruptura de la simetría plana de la actomiosina y protege el tejido epitelial de las deformaciones celulares. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Número 11, pg. e1007107.