Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

Resumen

Este protocolo proporciona una metodología fácil de usar basada en Fiji junto con instrucciones sencillas que explican cómo analizar de manera confiable el comportamiento de la actomiosina en células individuales y tejidos epiteliales curvos. No se requieren habilidades de programación para seguir el tutorial; todos los pasos se realizan de forma semi-interactiva utilizando la interfaz gráfica de usuario de Fiji y los plugins asociados.

Resumen

Los óvulos inmaduros de Drosophila se llaman cámaras de huevo, y su estructura se asemeja a órganos primitivos que sufren cambios morfológicos de una forma redonda a una forma elipsoides durante el desarrollo. Este proceso de desarrollo se llama oogénesis y es crucial para generar huevos maduros funcionales para asegurar la próxima generación de moscas. Por estas razones, las cámaras de huevo han servido como un modelo ideal y relevante para entender el desarrollo de órganos animales.

Se han desarrollado varios protocolos de cultivo in vitro, pero hay varias desventajas en estos protocolos. Se trata de la aplicación de varias cubiertas que ejercen una presión artificial sobre las cámaras de huevo con imágenes con el fin de inmovilizarlas y aumentar el plano de adquisición de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo analizadas. Tal enfoque puede influir negativamente en el comportamiento de la delgada maquinaria de actomiosina que genera el poder de girar las cámaras de huevo alrededor de su eje más largo.

Por lo tanto, para superar esta limitación, cultivamos las cámaras de óvulos Drosophila libremente en los medios de comunicación con el fin de analizar de forma fiable la maquinaria de actomiosin a lo largo de la circunferencia de las cámaras de óvulos. En la primera parte del protocolo, proporcionamos un manual que detalla cómo analizar la maquinaria actomiosina en un plano de adquisición limitada a escala celular local (hasta 15 células). En la segunda parte del protocolo, proporcionamos a los usuarios un nuevo complemento basado en Fiji que permite la extracción simple de una capa delgada definida de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo. A continuación, el siguiente protocolo describe cómo analizar las señales de actomiosina a la escala tisular (>50 células). Finalmente, identificamos las limitaciones de estos enfoques tanto en las escalas celulares y tisulares locales como en su posible desarrollo futuro y posibles aplicaciones.

Introducción

El desarrollo continuo de nuevas tecnologías de imagen y software con aplicaciones en las ciencias de la vida ha proporcionado un enorme impacto en la comprensión de los principios básicos de la vida. Uno de los principales desafíos es la visualización fiable de los procesos de desarrollo en combinación con sus imágenes en vivo en diversos tejidos. Los tejidos son partes de órganos y cuerpos y, como tales, la mayoría no son fácilmente accesibles para la toma de imágenes. Por lo tanto, se han desarrollado protocolos que permiten su disección y el cultivo in vitro con el fin de visualizar eventos biológicos que reflejan suficientemente la situación in vivo dentro de un cuerpo vivo.

Durante las últimas décadas, el cultivo y la toma de imágenes en vivo de las cámaras de óvulos Drosophila, estructuras similares a los acinares que se asemejan a órganos primitivos, ha contribuido inmensamente a la comprensión de los principios básicos del desarrollo primitivo de órganos^{1 , 2 , 3}. Actualmente, hay varios protocolos de cultivo disponibles, y su uso depende del tiempo de adquisición, el tipo de celda a la imagen y su accesibilidad (por ejemplo, línea germinal interna frente a línea somática externa)⁴.

Una característica común en todos estos protocolos de cultivo es la necesidad de la inmovilización de cámaras de huevo analizadas que muestran una alta actividad contráctea en medios líquidos. La actividad contráctea de las cámaras de huevo es causada principalmente por la hoja muscular que cubre una larga cadena de cámaras de huevo conectadas^5,6,7. Por lo tanto, para lograr la inmovilización adecuada de las cámaras de huevo joven, se han desarrollado varios enfoques, que implican cubrir las cámaras de huevo con cubretapas^6,8,9 o mantas flexibles^{4, 10} o incrustarlos en agarosa de punto bajo^3,11. Estos enfoques son populares, ya que también permiten la toma de imágenes de un plano visual más grande debido al aplanamiento sutil de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo.

Sin embargo, recientemente, se ha demostrado que las cámaras de huevo joven (etapa 1-8) giran alrededor de su eje anterior-posterior⁶ y que este movimiento tisular es impulsado por una fina red de actomiosina cerca de la superficie circunferencial de estas cámaras ^{de huevo jóvenes 12}. Por lo tanto, la alteración artificial de la superficie celular causada por un aplanamiento sutil de este tejido puede tener un impacto negativo en el comportamiento de la maquinaria de actomiosina generadora de fuerza. El contrapunto es que si el tejido de la cámara de óvulos no se aplana, la imagen microscópica de proteínas en la superficie circunferencial de las cámaras de óvulos se vuelve aún más limitada por la disminución del tamaño del plano de adquisición.

Por lo tanto, hemos combinado protocolos de Prasad et al.⁹ y el laboratorio de Celeste Berg^4,10 y los hemos modificado para que no se utilice ninguna manta/agarosa flexible en el método desarrollado. Las cámaras de huevo drosofilia se cultivan libremente en los medios de comunicación y el protocolo que se presenta aquí sólo se aplica a la microscopía invertida. Hay dos partes en el protocolo. La primera parte se centra en el análisis de señales de actomiosina a escala celular local (hasta 15 células) dentro de las cámaras de óvulos. En la segunda parte, nos centramos en superar las limitaciones asociadas con un pequeño plano de adquisición causados por el cultivo libre de cámaras de huevo. En este sentido, hemos desarrollado un nuevo método computacional basado en Fiji con una interfaz gráfica de usuario semiinteractiva que extrae selectivamente y despliega capas definidas de una superficie de tejido circunferencial. Esto es seguido por un protocolo que describe cómo analizar la actomiosina a la escala tisular (es decir, >50 células). Como la extracción selectiva de una capa delgada definida de tejidos epitelialescurvos no ha sido fácilmente posible utilizando una proyección clásica de la pila z (Figura 1), este método fácil de usar sirve como un requisito previo importante para entender comportamiento de una red de actomiosina delgada (<1 m) a la escala tisular en las cámaras de óvulos de Drosophila.

Además, para facilitar el protocolo, proporcionamos películas de lapso de tiempo (TM) de ejemplo y archivos de muestra de comportamiento Myosin II convencional no muscular etiquetado fluorescentemente (consulte Archivo complementario 3). La miosina II es una proteína motora y representa la parte contrácta activa de la maquinaria actomiosina. Para la imagen de Myosin II, utilizamos líneas transgénicas Drosophila que contienen una cadena de luz reguladora modificada de Myosin II llamada MRLC::GFP (ver Tabla de Materiales para más detalles)^12,13. Para visualizar las membranas celulares, el protocolo se basa en destisos comerciales (ver Tabla de Materiales). Este protocolo es adecuado no sólo para el análisis de pequeñas señales subcelulares MRLC::GFP^12, sino también para cualquier partícula subcelular de tamaño similar alrededor de 300 m, como las observadas con Life-Act::GFP^12,14.

Aunque ambos protocolos se presentan utilizando cámaras de huevo Drosophila cultivadas in vitro, la adquisición de señales de actomiosina también se puede realizar utilizando otros tejidos tras la optimización de los medios de cultivo y dependiendo de la disponibilidad proteínas etiquetadas fluorescentes con los colorantes comerciales correspondientes o, por ejemplo, microinyecciones de ARNm para obtener perfiles transitorios de expresión génica. Del mismo modo, el protocolo basado en Fiji para la extracción de una capa delgada de una superficie circunferencial se puede aplicar de forma más general a tejidos elipsoides y similares a órganos.

Protocolo

NOTA: El siguiente protocolo proporciona instrucciones sobre cómo analizar la actomiosina en la celular local y la escala tisular en las cámaras de óvulos Drosophila. El enfoque a escala local permite a los usuarios analizar el comportamiento detallado de la actomiosina en hasta 15 células por cámara de óvulos y requiere la adquisición de TLM sin antes (5-10 min) mediante el uso de imágenes de alta velocidad y un microscopio confocal invertido. Por el contrario, la escala tisular proporciona a los usuarios información de actomiosina en 50–100 células y requiere la adquisición de TLM durante un largo período de tiempo (30 min) mediante el uso de imágenes de baja velocidad y un microscopio de disco giratorio invertido (ver Figura 2 y parámetros recomendados en cada escala del Cuadro 1). La decisión a qué escala analizar las señales de actomiosina depende enteramente de la cuestión científica del usuario. Los TMN de prueba acompañados deben ayudar a tomar esta decisión.

1. Escala celular local (LCS)

NOTA: Para diseccionar e imaginar cámaras de huevo Drosophila cultivadas in vitro, siga el protocolo descrito en Archivo Suplementario 1. Para analizar los TlM adquiridos, continúe con el siguiente protocolo. Los enlaces a los archivos de prueba adjuntos de TlM se proporcionan en el archivo complementario 3.

1. Procesamiento de datos de TLM a escala celular local (LCS)
   1. Corrección de lejía de TLMs para compensar la decadencia de intensidad de las etiquetas fluorescentes
      1. Asegúrese de que una aplicación actualizada de Fiji está instalada en el equipo que se utiliza siguiendo estas instrucciones: Fiji > Abrir un TLM (por ejemplo, TestMovie1.tif desde el archivo complementario 3).
      2. Divida los canales de color haciendo clic en Imagen > Color > Dividir canales.
      3. Realice una corrección de lejía en ambos canales utilizando Imagen > Ajustar > Corrección de lejía > Relación simple > Intensidad de fondo 0.0.
         NOTA: Si se obtienen resultados insatisfactorios, explore qué métodos de corrección en este plugin se ajustan mejor (por ejemplo, utilice Histograma coincidencia en lugar de una relaciónsimple).
   2. Segmentación celular para generar una máscara de celda para TLMs
      1. Si Fiji aún no está abierto, vuelva a abrirlo (y asegúrese de que está actualizado) siguiendo la Ayuda > Actualización > Aplicar cambios > Aceptar.
      2. Si esto aún no se ha hecho, descargue la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (desde http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). Arrastre y suelte este script en Fiji.
      3. Abra el archivo TLM .tiff corregido por lejía (consulte la sección 1.1.1). Divida los canales del archivo corregido por lejía utilizando Imagen > Color > Dividir canales.
      4. Ejecute el script cargado en el canal de membrana de celda activa del TLM seleccionado pulsando el icono Ejecutar en el script abierto. Establezca el desenfoque gaussiano en 2.500 y la sensibilidad de detección de celdas en -1 y haga clic en Aceptar. Para obtener una buena máscara de celda, no cambie estos parámetros anteriores. Establezca la tolerancia de ruido estimada entre 10 y 20 para los TMM adquiridos con el objetivo 63x y haga clic en Aceptar.
         NOTA: Para otros objetivos, pueden ser necesarios diferentes parámetros. Cuanto más limpio sea el fondo en un TLM, se requiere la menor tolerancia de ruido estimada.
      5. Una máscara de celda generada aparece en el TLM analizado y también en una nueva ventana llamada ParticleStack (G)y, además, aparece una pequeña ventana llamada Acción requerida. Desde la máscara de celda en el TLM, céntrese solo en las celdas en el centro del TLM y seleccione aquellas que puedan proporcionar contornos completos y bien definidos a lo largo del TLM.
      6. Si las celdas seleccionadas contienen contornos de celda artificiales/adicionales, utilice la ventana de herramientas de combinación denominada Acción requerida en el TLM. Para este último, siga las instrucciones de la ventana.
         NOTA: Asegúrese de que los contornos celulares estén bien definidos y correspondan a membranas celulares reales en un TLM, ya que cualquier imprecisión puede afectar a los análisis posteriores. Los ajustes y cambios adicionales, como la eliminación de celdas no deseadas, se pueden realizar más adelante con la herramienta Administrador de superficies (descrita en la sección 1.1.3).
      7. Cuando las celdas seleccionadas en el centro se correspondan muy bien con las membranas celulares reales, guarde ParticleStack como un archivo .tiff siguiendo Archivo > Guardar como > Tiff.
   3. Carga de la máscara de celda generada en el Administrador de superficies
      1. Instale Surface Manager Plugin¹⁵ en la configuración de Fiji utilizada. Siga las instrucciones de Viktorinova et al.¹⁶.
      2. Abre el Administrador de superficies con Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D).
         NOTA: La ventana administrador de superficies muestra varios botones de acción a la derecha y una ventana vacía a la izquierda. Para ver todos los botones de acción, puede ser necesario estirar la ventana en su altura / anchura. Tenga en cuenta que los marcos de tiempo aparecerán como cortes z.
      3. Abra el archivo .tiff de ParticleStack correspondiente en Surface Manager haciendo clic en Archivo > Abrir y seleccione la imagen que desea abrir (por ejemplo, ParticlesStack1.tif).
      4. En el Administrador de superficies, haz clic en el botón Leer imagen de contorno y establece el índice Jacquard en 60%.
         NOTA: La carga del archivo ParticlesStack1.tif puede tardar hasta varios minutos, dependiendo de la potencia de procesamiento del equipo.
      5. Una vez cargada, cada celda se asignará con un número S y aparecerá en la parte izquierda de la ventana del Administrador de superficies.
         NOTA: Para mostrar contornos y nombres de celda para todas las celdas, marca las casillas Mostrar todo y Mostrar etiquetas en la parte inferior de la ventana del Administrador de superficies. Se recomienda utilizar esta función una vez que los números de celda se han comprobado para su corrección.
      6. Haga clic en el primer número S; el contorno de celda importado de ParticlesStack1.tif aparece en el TLM. Compruebe cada número S importado para la calidad del contorno de celda en todo el TLM y elimine las celdas no deseadas que muestran contornos de celda incorrectos. Para ello, resalte el contorno de la celda y haga clic en el botón Eliminar.
         NOTA: También es posible corregir los contornos de celda imprecisos y agregar nuevos contornos de celda. Esto se describe en la sección de discusión.
      7. Guarde todas las celdas corregidas como un archivo RoiSet.zip pulsando el botón Guardar en disco.
         NOTA: Si es necesario interrumpir la sesión, es posible cargar el archivo RoiSet en el Administrador de Surface más adelante: abra un TLM en Fiji (Archivo > Abrir) y seleccione un TLM. Abre el Administrador de superficies a través de Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D). Cargue el archivo RoiSet.zip correspondiente haciendo clic en el botón Cargar desde disco y eligiendo el archivo RoiSet.zip adecuado. Compruebe que las máscaras de celda cargadas corresponden al TLM cargado.
   4. Corrección de la deriva tisular en LOS TM
      NOTA: Durante el tiempo de adquisición de los TM, se pueden observar efectos de deriva debido a la rotación epitelial o un movimiento no deseado. En ambos casos, recomendamos corregir cualquier deriva con el fin de simplificar el análisis manual de actomiosina más adelante. La corrección de deriva solo es necesaria para el análisis manual de actomiosina. Este tutorial requiere el software de Fiji actualizado con el complemento MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) instalado.
      1. Abra el TLM corregido por lejía en Fiji a través de Archivo > Abrir y seleccione el archivo corregido por lejía creado con el tutorial mencionado anteriormente.
      2. Divida los canales y seleccione el que identifica las membranas celulares a través de Imagen > Color > Canales divididos.
      3. Utilice el siguiente protocolo cuando los contornos de celda no sean visiblemente suaves: Proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano. Establézcalo en 1–2 para un objetivo de 63x y haga clic en Aceptar y, a continuación, en Sí. Haga clic en Proceso > Binario > Convertir en máscara utilizando la configuración predeterminada; a continuación, haga clic en Aceptar.
      4. Cargue el complemento MultiStackReg siguiendo Plugins > Registro > MultiStackReg.
      5. Asegúrese de que la pila 1 esté establecida en el canal de membrana celular, la acción 1 se establece en Alinear y transformación se establece en Traducción. Active la casilla Guardar archivo de transformación y, a continuación, haga clic en Aceptar.
      6. Vuelva a abrir el TLM seleccionado, el complemento MultiStackReg y el archivo de transformación guardado mediante Archivo > Abrir y seleccione un TLM. Divida los canales de color con Imagen > Color > Dividir canales.
      7. Cargue el complemento MultiStackReg haciendo clic en Plugins > Registro > MultiStackReg. Seleccione Cargar archivo de transformación como acción 1.
      8. Deje Transformación como cuerpo rígido y haga clic en Aceptar. Seleccione el archivo de transformación guardado anteriormente y haga clic en Aceptar de nuevo.
      9. Combine los canales de imagen y guarde el TLM registrado como un archivo .tiff siguiendo Imagen > Color > Combinar canales. Guarde el archivo haciendo clic en Archivo > Guardar como > Tiff.
         NOTA: Hay formas alternativas de corregir una deriva de tejido en Fiji, a saber, a través de Plugins > Registro > StackReg/Correct 3D drift.
2. Análisis de pulsos de actomiosina en Surface Manager en LCS
   NOTA: Este paso de protocolo permite a los científicos identificar si los pulsos de actomiosina están presentes en el tejido analizado y comprender el comportamiento detallado, así como la direccionalidad de las señales de actomiosina.
   1. Abra Fiji y asegúrese de que un TLM y su máscara de celda correspondiente estén abiertos en el Administrador de superficies.
      NOTA: Asegúrate de que Fiji esté instalado y actualizado y de que el complemento de Surface Manager esté instalado (paso 1.1.3.1).
   2. Abra un TLM con Archivo > Abrir y seleccione un TLM para abrirlo (por ejemplo, TestMovie1_bleach.tif). Cargue el complemento Administrador de superficies a través de Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D). Cargue la máscara de celda guardada creada en el tutorial aquí (por ejemplo, ParticlesStack1.tif) a través de Archivo > Abrir y seleccione una máscara de celda (por ejemplo, ParticlesStack1.tif). Cargue la región de interés correspondiente (ROI, por ejemplo, TestMovie1_RoiSet.zip). Vea la figura 3A.
   3. Cambie al canal de interés en el TLM seleccionado.
      NOTA: Para distinguir los canales, siga el código de color indicado alrededor del TLM.
   4. En el Administrador de superficies, haga clic en el botón Estadísticas para obtener la ventana denominada Valor gris medio sector por sector ( Figura3B). Tenga en cuenta que se mostrarán los valores de intensidad media/mediana de las señales de actomiosina en un canal analizado determinado dentro de los contornos de celda definidos a lo largo del tiempo, así como otros parámetros relacionados con el área de celda y la forma de la celda.
      NOTA: Los valores de intensidad están en unidades de arbitraty (A.U.); el área de la celda está en píxeles y necesita ser convertido en micrómetros cuadrados.
   5. Guarde los valores obtenidos como un archivo de hoja de cálculo. Haga clic en la ventana Estadísticas, Archivo > Guardar como.
      NOTA: Es posible verificar los valores estadísticos obtenidos más adelante de la siguiente manera: abrir el TLM corregido con lejía en Fiji y abrir el administrador de Surface. Cargue el RoiSet.zip correspondiente en el TLM pulsando el botón Cargar desde disco y abra el archivo. La máscara guardada con contornos de celda se cargará y los nombres de las celdas aparecerán en la ventana izquierda del Administrador de superficies. Haga clic en el botón Estadísticas para ver los valores estadísticos.
3. Análisis manual de señales de actomiosina subcelulares individuales en LCS
   NOTA: Este protocolo requiere la mayor concentración y consume mucho tiempo. En general, un TLM adquirido se puede analizar cómodamente dentro de 1 día. Esto no incluye el tiempo para la preparación de la mosca antes de su disección, la disección en sí y la adquisición de imágenes.
   1. Abra un TLM seleccionado, corregido por lejía y registrado (corregido a la deriva) en una solicitud actualizada de Fiji. Utilice un TLM corregido por lejía y corrección a la deriva (por ejemplo, TestMovie1_bleach_reg.tif) como ejemplo de prueba.
   2. Ajuste el brillo y el contraste para ver las señales individuales de actomiosin utilizando Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste.
   3. Alinee los TLM en la misma dirección en relación con el eje tejido/cuerpo. En el caso de las cámaras de huevo, alinee el lado anterior de las cámaras de huevo siempre a la izquierda de la imagen/subpelícula/TLM antes del análisis.
   4. Divida la película seleccionada en subpelículas cortas de 30 s y proyecte cada una de ellas. Guarde subpelículas no proyectadas en tiempo y proyectadas en el tiempo con los nombres correspondientes. Guarde la fuente original.
      NOTA: Las subpelículas se pueden crear a partir de TLM originales eliminando primero fotogramas no deseados a través de Imagen > Pilas > Eliminador de sectores. Defina los sectores que se van a eliminar y establezca Incremento. Transforme a RGB antes de utilizar el removedor de cortes cuando Increment . Para proyectar un subpelícula de 30 s, haga clic en Imagen > Pilas > Proyecto Z > Intensidad máxima para los fotogramas definidos (sectores) y, a continuación, haga clic en Aceptar. Omita cada segundo subpelícula de 30 s para evitar contar las señales de actomiosina 2x en dos subpelículas posteriores de 30 s.
   5. Coloque una imagen proyectada en el tiempo junto a la subpelícula de 30 s correspondiente (Figura4A,B). Identifique la línea de señal en la subpelícula proyectada en el tiempo. Identifique la dirección del movimiento de la señal de actomyosin (0o–360o) a lo largo de esta línea en la subpelícula original reproduciendo manualmente la subpelícula. Utilice la herramienta Angulo (en la barra de Fiji) para medir manualmente la dirección del movimiento de la señal en relación con el eje de tejido definido o una herramienta similar disponible.
      NOTA: Fiji sólo trabaja en una escala de 0 a 180o (figura4C),y se requiere un nuevo cálculo de los valores obtenidos en una escala de 0 a 360o. Una línea de señal corresponde a la trayectoria de un movimiento de señal actomiosina a lo largo del tiempo.
   6. Para evitar la duplicación en el análisis de señales de actomiosina, marque las líneas de señal analizadas dentro de las celdas en la subpelícula proyectada en el tiempo (Figura4B,D).
   7. Analice todas las celdas seleccionadas en la subpelícula de 30 s y guarde los ángulos obtenidos.
      NOTA: Analizar sólo señales de actomiosina citoplasmática subcelular en células con contornos celulares bien definidos a lo largo de un TLM. Excluya las células individuales con menos de 15–20 señales detectadas en todo el TLM. Ignore las señales de actomiosina que se mueven a través de las células debido a su origen desconocido. Un ejemplo de recuento de señales para una celda analizada en la subpelícula de 30 s se muestra en la Figura 4D.
   8. Continúe hasta que se analicen las subpelículas de 30 s de largo de un TLM y guarde todos los ángulos medidos de las señales de actomiosina de un TLM en un archivo de hoja de cálculo.
   9. Sume todos los ángulos medidos sobre el número relevante de TlM (dependiendo del experimento). Trazar el porcentaje de la dirección de las señales de actomiosina analizadas, por ejemplo, como un diagrama de rosas con un rango de 0 a 360o con un software preferido.
      NOTA: Para obtener resultados estadísticamente significativos, se recomienda analizar de cinco a diez cámaras de huevo independientes de cualquier etapa de la cámara de óvulos.

2. Escala de tejido

NOTA: Para diseccionar e imaginar cámaras de huevo Drosophila cultivadas in vitro, siga el protocolo en Archivo Suplementario 2. Para analizar los TlM adquiridos, continúe con el siguiente protocolo a continuación. Los archivos de prueba acompañados de TLMs se colocan en el archivo complementario 3.

1. Extracción selectiva de superficie de tejidos epiteliales curvos
   Nota:Este protocolo permite a los usuarios extraer selectivamente una fina capa de actomiosina en un tejido epitelial curvo con el tiempo. Este paso de protocolo es fácil de usar y se basa en una interfaz gráfica intuitiva. Es posible analizar cómodamente (extraer superficie) varios TLM. Use TestMovie2.czi (de laArchivo Suplementario 3) como ejemplo de TLM de prueba.
   1. Abra una aplicación actualizada de Fiji (Fiji > Ayuda > Actualización > Aplicar cambios > Aceptar).
   2. Asegúrese de que el complemento de proyección de superficie elipsoide¹⁵ está instalado. Seguir a Alejandra Y A. ¹⁶.
   3. Abra un TLM y expórtelo como un archivo XML/HDF5 haciendo clic en Plugins > BigDataViewer > Exportar imagen actual como archivo XML/HDF5.
      NOTA: Es necesario definir una ruta de exportación. El guardado en sí puede tardar varios minutos y depende de la longitud del TLM.
   4. Abra el archivo exportado en Proyección de superficie elipsoide haciendo clic en Plugins > BigDataViewer > Proyección de superficie elipsoide > Seleccionar archivo XML.
      NOTA: Aparecerá una nueva ventana con vistas sagital de la cámara de huevos y un cuadro de diálogo para guiar al usuario a través del procesamiento. Los detalles sobre cómo navegar en la vista de sectorse se pueden encontrar en https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. La ventana de diálogo llamada Proyección de Ovarios tiene varias pestañas. En la primera pestaña de diálogo denominada Cuadro delimitador, defina los bordes x e y de una cámara de huevos en el TLM junto con el ancho z del cuadro delimitador (es decir, la profundidad de una cámara z-stack/egg) y pulse set (Figura 5A).
   6. Para definir bordes, arrastre los botones situados junto a x, y y z o defina las coordenadas numéricas en los cuadros x, y y z. Asegúrese de que los bordes son lo suficientemente generosos como para conseguir la parte de la cámara de huevo de interés en la extracción de la superficie. Las partes seleccionadas de la cámara de huevo se resaltan en rosa.
   7. Cambie a la pestaña Buscar blobs en la ventana Proyección de Ovarios. Defina el sigma y el valor máximo mínimo; a continuación, presione compute para identificar las señales de actomyosin (Figura5B),que aparecerán como blobs verdes. Vuelva a intentar este paso con diferentes parámetros hasta que se encuentren suficientes puntos (alrededor de 100).
      NOTA: Sigma 1-u20123 con un valor máximo mínimo de 20-u2012100 funciona mejor para identificar las señales de actomiosina de las cámaras de huevo de etapa 6 a -8. Identificar las señales de actomiosina es un paso crucial y depende de la calidad de la señal y su tamaño. Es importante confirmar el tamaño correcto de los blobs existentes. No hay manchas/blobs verdes visibles en la imagen significa que el siguiente paso no funcionará. Examine los planos z seleccionados para ver los blobs.
   8. Para diseñar el elipsoide, continúe con la pestaña llamada Fit elipsoide. Establezca Muestras aleatorias en 10.000, Distancia de corte exterior/interior en 1-u201210 y, a continuación, haga clic en Calcular (Figura 5C).
      NOTA: Cuanto menor sea la distancia de corte, más preciso será el elipsoide deseado. Después de esto, la pestaña llamada Proyección se abrirá automáticamente y permite la definición de la extracción de la superficie. Es necesario optimizar la configuración.
   9. Continúe más adelante con la pestaña llamada Proyección (Figura 5D). Configure una distancia de proyección mínima y máxima (es decir, la anchura del elipsoide deseado). Se requiere establecer una distancia de proyección mínima y máxima para que la región elipsoide definida rosa incluya toda la capa exterior de la cámara de huevo. Defina la distancia del sector (se recomienda 1).
      NOTA: En la Figura 6A,Cse muestran ejemplos de un ajuste elipsoide incorrecto y óptimo que da como resultado parámetros de proyección incorrectos y óptimos. La capa circunferencial delgada del interés se puede definir más adelante. Asegúrese de que la región rosa del elipsoide con el ancho definido en la cámara de huevo sea visible antes de presionar la computación. Es importante que el elipsoide deseado (línea única rosa) se adapte bien a la superficie elipsoide de una cámara de huevo con el fin de obtener los mejores resultados. Si el ajuste elipsoide no es bueno, organice diferentes ajustes hasta obtener la extracción de superficie deseada.
      1. Establezca un ancho de salida (800) y una altura (400) del elipsoide. Establezca desde qué punto de tiempo hasta qué punto de tiempo se debe crear la extracción de superficie (es decir, defina la longitud de la extracción de TLM). Elija una proyección esférica o cilíndrica. Voltee Z y alinee Y si es necesario.
      2. Presione calcular para obtener una extracción de superficie para ambos canales en ventanas nuevas denominadas Imagen. Ajuste el brillo y el contraste de las ventanas de imagen obtenidas para poder ver las señales de actomiosina proyectadas, haciendo clic en Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste.
         NOTA: En la Figura 6B,Dse muestra un ejemplo de comparación de una proyección resultante de un ajuste elipsoide incorrecto y óptimo.
   10. Si la extracción de superficie se ve bien, guarde las imágenes (ambos canales por separado) como .tiff. Además, guarde el archivo de ventana de registro para futuras referencias sobre cómo se extrajo la superficie de esta cámara de huevo en particular.
       NOTA: Esta es información particularmente importante si la capa delgada extraída debe volver a su forma original desplegada (solo para desarrolladores).
   11. Combine los canales con un código de color preferido en Fiji.
       NOTA: Si es necesario, proyecte las capas de pila z seleccionadas con señales de actomiosina. La proyección de las capas de pila z seleccionadas es necesaria cuando el foco de adquisición cambia ligeramente con el tiempo en un TLM. Para obtener los mejores resultados, proyecte como máximo una a dos capas de pila z.
   12. Guarde los resultados como archivos .tiff.
       NOTA: En la Figura 8se pueden encontrar ejemplos representativos de capas delgadas (superficie basal selectiva y apical) que representan la señal de Miosin II (MRLC::GFP) del epitelio folículo de las cámaras de huevo mutantes de control y grasa2.
2. Procesamiento de datos de una superficie de tejido extraída selectivamente
   1. Corrija la lejía de los TLM para compensar la descomposición de la intensidad de las etiquetas fluorescentes.
      1. Abra Fiji. Abra un TLM (por ejemplo, TestMovie2_extraction.tif desde el archivo complementario 3) utilizando Archivo > Abrir. Seleccione la imagen para abrirla.
      2. Divida los canales de color y conviértalos en imágenes de 16 bits, si es necesario, haciendo clic en Imagen > Color > Dividir canales. Convierta los canales en imágenes de 16 bits (a partir de imágenes de 32 bits) utilizando Imagen > Texto > 16 bits.
      3. Realice una corrección de lejía en ambos canales utilizando Imagen > Ajustar > Corrección de lejía > Relación simple > Intensidad de fondo 0.0.
         NOTA: Si se obtienen resultados insatisfactorios, es necesario explorar qué métodos de corrección en este plugin se ajustan mejor (por ejemplo, utilizar la coincidencia de histograma en lugar de una relación simple).
      4. Combine los canales de las dos imágenes corregidas por lejía haciendo clic en Imagen > Color > Fusionar canales. Guarde la imagen combinada como un archivo .tiff haciendo clic en Archivo > Guardar como > Tiff.
         NOTA: Ajuste el contraste y el brillo de los canales si es necesario.
   2. Segmentación celular para generar una máscara de celda para TLMs
      1. Si Fiji aún no está abierto, vuelva a abrirlo (y asegúrese de que esté actualizado haciendo clic en Ayuda > Actualizar > Aplicar cambios > Aceptar).
      2. Si esto aún no se ha hecho, descargue la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Arrastre y suelte este script en Fiji. Abra el archivo corregido por lejía (por ejemplo, TestMovie2_bleach.tif desde el archivo complementario 3, véase también 2.2.1).
      4. Divida los canales del archivo corregido por lejía haciendo clic en Imagen > Color > Dividir canales. Ajuste el canal de membrana para asegurar contornos de celda claros haciendo clic Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste.
      5. Ejecute el script cargado en el canal de membrana de celda activa del TLM seleccionado pulsando el icono Ejecutar en el script abierto. Establezca Desenfoque gaussiano en 1.500. Establezca la sensibilidad de detección de celdas en -1 y haga clic en Aceptar. Establezca Tolerancia de ruido estimada en 8 para los TMMM adquiridos con el objetivo 40x y haga clic en Aceptar.
         NOTA: Para obtener una buena máscara de celda, no cambie estos parámetros anteriores. Para otros objetivos, pueden ser necesarios diferentes parámetros. Cuanto más limpio sea el fondo en un TLM, se requiere la menor tolerancia de ruido estimada.
      6. Una máscara de celda generada aparece en el TLM analizado y también en una nueva ventana llamada ParticleStack (G). Además, aparece una pequeña ventana llamada Acción requerida. Desde la máscara de celda en el TLM, céntrese solo en las celdas en el centro del TLM y seleccione aquellas que puedan proporcionar contornos completos y bien definidos a lo largo del TLM.
      7. Si las celdas seleccionadas contienen contornos de celda artificiales/adicionales, utilice la ventana de herramientas de combinación denominada Acción necesaria en el TLM. Para este último, siga las instrucciones de la ventana.
         NOTA: Asegúrese de que los contornos celulares estén bien definidos y correspondan a membranas celulares reales en un TLM, ya que cualquier imprecisión puede afectar a los análisis posteriores. Los ajustes y cambios adicionales, como la eliminación de celdas no deseadas, se pueden realizar más adelante con la herramienta Administrador de superficies (delineado en el tutorial siguiente).
      8. Cuando las celdas seleccionadas en el centro se correspondan muy bien con las membranas celulares reales, guarde ParticleStack como un archivo .tiff siguiendo Archivo > Guardar como > Tiff. Proceda a realizar la carga de la máscara de celda generada y el análisis de actomyosin en Surface Manager como se realizó anteriormente en las secciones 1.1.3 y 1.2 (también descrita en detalle en las secciones 2.2.3 y 2.3).
   3. Carga de la máscara de celda generada en el Administrador de superficies
      1. Si el complemento de Surface Manager ya está instalado en la configuración de Fiji utilizada, continúe con el paso 2. Si no es así, siga Viktorinova et al.¹⁶. Para los desarrolladores, sólo el código fuente también está disponible¹⁵.
      2. Abra Surface Manager haciendo clic en Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D).
         NOTA: La ventana administrador de superficies muestra varios botones de acción a la derecha y una ventana vacía a la izquierda. Para ver todos los botones de acción, puede ser necesario estirar la ventana en su altura / anchura. Tenga en cuenta que los marcos de tiempo aparecerán como cortes z.
      3. Abra el archivo ParticleStack.tif correspondiente en Surface Manager a través de Archivo > Abrir y seleccione la imagen que desea abrir (por ejemplo, ParticleStack2.tif desde el archivo complementario 3).
      4. En el Administrador de superficies, haz clic en el botón Leer imagen de contorno y establece el índice Jacquard en 60%.
         NOTA: La carga de un archivo ParticleStack.tif puede tardar hasta varios minutos, dependiendo de la potencia del equipo.
      5. Una vez cargada, cada celda se asignará con un número S y aparecerá en la parte izquierda de la ventana del Administrador de superficies (Figura7A).
         NOTA: Para mostrar contornos y nombres de celda para todas las celdas, marca las casillas Mostrar todo y Mostrar etiquetas en la parte inferior de la ventana del Administrador de superficies. Se recomienda utilizar esta función una vez que los números de celda se han comprobado para su corrección.
      6. Haga clic en el primer número S; el contorno de celda importado de ParticleStack.tif aparece en el TLM. Compruebe cada número S importado para la calidad del contorno de celda en todo el TLM y elimine las celdas no deseadas que muestran contornos de celda incorrectos. Para ello, resalte el contorno de la celda y haga clic en el botón Eliminar.
         NOTA: También es posible corregir los contornos de celda imprecisos y agregar nuevos contornos de celda. Esto se describe en la sección de discusión.
      7. Guarde todas las celdas corregidas como un archivo RoiSet.zip pulsando el botón Guardar en disco.
         NOTA: Si es necesario interrumpir la sesión, es posible cargar el archivo RoiSet.zip en el Administrador de Surface más adelante: abra un TLM en Fiji a través de Archivo > Abrir y seleccione un TLM. Abra el Administrador de superficies de la siguiente manera: Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D). Cargue el roiSet.zip correspondiente haciendo clic en el botón Cargar desde disco y eligiendo el archivo RoiSet.zip adecuado (por ejemplo, TestMovie2_RoiSet.zip). Compruebe que las máscaras de celda cargadas corresponden al TLM cargado.
3. Análisis de pulsos de actomiosina en el Administrador de superficies
   NOTA: Abra Fiji y asegúrese de que un TLM y su máscara de celda correspondiente estén abiertos en el Administrador de superficies. Asegúrate de que Fiji esté instalado y actualizado y de que el complemento de Surface Manager (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) esté instalado.
   1. Abra un TLM con Archivo > Abrir y seleccione un TLM para abrirlo (por ejemplo, TestMovie2_bleach.tif). Carga el complemento Administrador de Surface a través de Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D). Cargue la máscara de celda guardada creada en el tutorial aquí (por ejemplo, ParticlesStack2.tif) a través de Archivo > Abrir y seleccione una máscara de celda (por ejemplo, ParticlesStack2.tif). Cargue el ROI correspondiente (por ejemplo, TestMovie2_RoiSet.zip).
   2. Cambie al canal de interés en el TLM seleccionado.
      NOTA: Para distinguir entre los canales, siga el código de color indicado alrededor del TLM.
   3. En el Administrador de superficies, haga clic en el botón Estadísticas para obtener la ventana denominada Valor gris medio sector por sector ( Figura7B). Tenga en cuenta que se mostrarán los valores de intensidad media/mediana de las señales de actomiosina en un canal analizado determinado dentro de los contornos de celda definidos a lo largo del tiempo, así como otros parámetros relacionados con el área de celda y la forma de la celda.
      NOTA: Los valores de intensidad están en A.U.; el área de la celda está en píxeles y necesita ser convertido en micrómetros cuadrados.
   4. Guarde los valores obtenidos como un archivo de hoja de cálculo: haga clic en la ventana Estadísticas, Archivo > Guardar como.
      NOTA: Es posible verificar los valores estadísticos obtenidos más adelante, de la siguiente manera. Abra el TLM corregido con lejía en Fiji. Abra el Administrador de superficies. Cargue el RoiSet.zip correspondiente en el TLM pulsando el botón Cargar desde disco y abra el archivo. La máscara guardada con contornos de celda se cargará y los nombres de las celdas aparecerán en la ventana izquierda del Administrador de superficies. Haga clic en el botón Estadísticas para ver los valores estadísticos.
      NOTA: En cuanto a un análisis manual de señales de actomiosina subcelulares individuales,no es posible realizar un análisis manual de las señales de actomiosina subcelular a escala tisular. La optimización es necesaria para el análisis de señales de actomiosina individuales a escala semi-tejido, como se destaca en la sección de discusión.

Resultados

Este protocolo permite a los científicos investigar el comportamiento de las redes de actomiosina en los tejidos epiteliales. Esto sólo es posible cuando un análisis detallado del comportamiento de la actomiosina a escala celular local (unas pocas células) se combina con un análisis similar a la escala tisular (muchas células). Sin embargo, los tejidos epiteliales son a menudo curvos y la extracción de una capa delgada de estos tejidos antes no era fácilmente posible, como se muestra en l...

Discusión

Pasos críticos y solución de problemas para la disección y el cultivo de cámaras de huevo

Si se colocan demasiadas moscas en un vial pequeño, el alimento de la mosca puede volverse fangoso después de 2-3 días debido a grandes cantidades de larvas de alimentación y moscas adultas que quedan atrapadas en la comida de la mosca. En tal caso, voltear el resto de estas moscas en un nuevo vial con alimentos frescos y reducir el tamaño de su número. En particular, excluya a las hembra...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamina
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140-122	[ +] 10.000 Unidades/mL Penicilina [+] 10.000 µ g/mL de estreptomicina
Suero Fetal Bovino	Sigma	F135
Solución de insulina inactivada por calor Sigma humano		I9278
50 mL Tubos Falcon	Eppendorf
Filtro estéril Millex-GV	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Fondo de vidrio Micropocillos MatTek	Corporation	P35G-1.5-14-C Placa de	Petri de 35 mm, Micropocillo de 14 mm, Nº 1.5
Pinzas de vidrio A	. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (tinte para membrana celular)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (colorante para membrana celular)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Portaobjetos de disección por depresión	Fisher Scientific	12-560B
Equipo microscópico
Steromicroscope	. ej., Microscopio confocal invertido Zeiss		Stemi SV 6
Microscopio de disco giratorio	Zeiss/Olympus
Vidrio microscópico/cubreobjetos	, p. ej., Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/cactus
barrilDrosophila stocks utilizados en el manuscrito
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			Para más detalles, véase Rauzi et al.: Los flujos contráctiles de actomiosina polarizados planos controlan la remodelación de la unión epitelial. Nature 2010, Vol. 468, págs. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			Para más detalles, véase Viktorinova et al.: La rotación epitelial está precedida por la ruptura de la simetría plana de la actomiosina y protege el tejido epitelial de las deformaciones celulares. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Número 11, pg. e1007107.