Aquí, presentamos un protocolo que implica genéticamente acoplado espectralmente distinto photoactivatable y proteínas fluorescentes. Estas quimeras de la proteína fluorescente permiten la cuantificación de la fracción PA-FP que es fotoactivado a ser fluorescentes, es decir, la eficacia de la fotoactivación. El protocolo revela que diversos modos de fotoactivación rendimiento fotoactivación diferentes eficiencias.
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Artículo de método
Cómo cuantificar la fracción de proteínas fluorescentes fotoactivado a granel y en células vivas
En este artículo
Resumen
Resumen
Photoactivatable y - proteínas fluorescentes convertibles (PA-FPs) se han utilizado en microscopía de fluorescencia células vivas para el análisis de la dinámica de las células y conjuntos de proteínas. Hasta ahora, ningún método ha estado disponible para cuantificar a granel y en vivo las células expresan cuántos de los PA-FPs son fotoactivado a fluorescencia.
Aquí, presentamos un protocolo de reglas internas, es decir, genéticamente acoplado espectralmente distintos (photoactivatable) proteínas fluorescentes, a ratiometrically cuantificar la fracción de FPs PA todas expresadas en una célula que se encienden al ser fluorescente. Mediante este protocolo, se muestra que diferentes modos de fotoactivación rindieron fotoactivación diferentes eficiencias. Fotoactivación de alta potencia corta con un láser confocal de barrido microscopio (CLSM) dio lugar a hasta cuatro veces inferior fotoactivación eficacia que cientos de exposiciones de bajo nivel aplicadas por CLSM o un pulso corto aplicado por iluminación de campo amplio. Mientras que el protocolo ha sido ejemplificado aquí para GFP (PA-) y (PA) cereza, puede en principio ser aplicado a cualquier par de proteína fluorescente espectralmente distintos photoactivatable o photoconvertible y cualquier montaje experimental.
Introducción
En 2002, la primera photoactivatable términos generales aplicable (PA-GFP1) y photoconvertible (Kaede2) proteínas fluorescentes fueron descritas. Estas proteínas fluorescentes ópticos resaltador cambian sus propiedades espectrales sobre la irradiación con luz UV, es decir, se convierten en brillantes (proteínas fluorescentes photoactivatable, es decir, PA-FPs), o cambiar su color (photoconvertible FPs). Hasta la fecha, varios reversibles e irreversibles photoactivatable y photoconvertible proteínas fluorescentes han sido desarrolladas3,4. En est....
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Protocolo
1. construcción de plásmido
- Generar puntas de prueba de fusión de dos colores. Utilizar un vector de expresión de células de mamífero (véase Tabla de materiales) en la que mCherry112 y13 de la PA-mCherry1 se han insertado con la restricción de sitios africanas y BsrGI.
- Orden personalizado oligo-nucleótidos para amplificar las variantes monoméricas de eGFP y que contiene la mutación de A206K, es decir, mEGFP y PA-mEGFP14 sin un codón de parada como un fragmento de BamHI SalI PA-eGFP. Utilice la cartilla del N-terminal 5'-AAT ....
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Resultados
El protocolo que presentamos muestra la cuantificación radiométrica de la fracción de proteínas fluorescentes que se fotoactiva que fluorescente (figura 1). Esta fracción varía dependiendo de la modalidad de fotoactivación.
Un resultado típico mediante fotoactivación de alta potencia de corto plazo con un láser confocal de barrido (CLSM) del microscopio se muestra en la figura 2.......
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Discusión
Hasta ahora, ningún método existió para determinar a granel la fracción de PA-FPs expresada en células vivas que se fotoactiva ser fluorescente. El protocolo presentado puede utilizarse para cualquier par de proteína fluorescente espectralmente distintos. Si bien ejemplificados aquí por el irreversible FPs PA PA-GFP y PA-cereza, este enfoque es en principio aplicable a las proteínas de la photoconvertible así. La proteína fluorescente espectralmente distinta, sin embargo, debe seleccionarse cuidadosamente para minimizar .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al laboratorio de Dorigo y el servicio de la proyección de imagen de Neurociencia en la escuela de medicina de la Universidad de Stanford para proporcionar espacio y equipo para este proyecto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| pEGFP-N1 vector de expresión de células de mamíferos | Clontech | ||
| DMEM sin rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Tripsina sin rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-glutamina (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Cámaras LabTek de 8 pocillos #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
Referencias
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A.
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