Artículo de método

Recuperación de biocitina y reconstrucciones 3D de interneuronas lleno Hippocampal CA2

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DOI:

10.3791/58592

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20 de noviembre de 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El protocolo que aquí describe el análisis de la inmunofluorescencia, recuperación de biocitina y reconstrucciones de alta calidad de interneuronas de CA2 hipocampales siguiendo los registros electrofisiológicos intracelulares in vitro, permitiendo neuronal caracterización y finalmente fina anatomía neuronal para ser estudiado.

Resumen

Cómo los procesos de actividad cortical en la red información es de importancia para un gran número de cuestiones científicas básicas y clínicas. El protocolo descrito aquí identifica los bloques de edificio básicos de este circuito. Los estudios detallados de regiones corticales en última instancia proporcionará otros científicos con los componentes del circuito necesario para comprender cómo el cerebro adquiere, procesa y almacena la información y lo que sucede en la enfermedad, mientras que los electrofisiológicos y datos morfológicos son ampliamente utilizados por los neurocientíficos computacionales en la construcción de redes de modelo que explore el procesamiento de la información. El protocolo descrito aquí describe células llenas de biocitina registradas en la región CA2 del hipocampo se recuperó y luego reconstruidas en 3D. Además, el protocolo describe la demostración de la proteína de unión a calcio o péptido contenido en interneuronas grabados.

Introducción

La corteza y el hipocampo son estructuras de una complejidad que la clasificación de neuronal subtipos1,2,3,4, mapas de las conexiones entre ellos5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 y cómo este circuito admite funciones cognitivas12,13,14,15 están aún bajo estudio intenso y el tema de continuo debate. Por ejemplo, para entender los detalles y la complejidad de los circuitos y para coordinar los datos obtenidos de muchos estudios diferentes, es muy útil poder definir y describir los componentes, pero sigue siendo un tema de debate cómo muchos diferentes clases de neuronas existentes, o incluso si es posible definir todas las neuronas como pertenecientes a una clase específica. Herramientas computacionales que pueden construir y probar circuitos con diferentes grados de complejidad están siendo desarrollados16,17,18, pero estos esfuerzos es la necesidad de estudios detallados de los tipos de células y de las propiedades de las conexiones entre ellos. Una gran cantidad de información sobre el circuito local del neocortex de ratas adultas ya se han recolectado usando el protocolo descrito aquí10,19,20,21, 22. aunque el "esquema" está lejos de ser completa, algunos claros patrones o reglas han surgido. Por otra parte, aunque algunos detalles varían, estas reglas son comunes a dos especies de mamíferos (ratas y gatos) y a través de varias regiones neocorticales, permitiendo el desarrollo de bloques básicos que pueden aplicarse igualmente a neocortex humano. La técnica descrita aquí se utiliza para ampliar nuestra comprensión del mapa funcional de los circuitos corticales mediante la identificación de las neuronas presinápticas y postsinápticas en las conexiones en las regiones que no han sido estudiadas en detalle antes, utilizando un protocolo que permite la preservación de tejidos excelente y notable recuperación tinción en tejido fino del cerebro adulto. Se han recabado datos sobre el circuito local de CA2 y propiedades neuronales en este subcampo con este método combinando grabaciones electrofisiológicas intracelulares (grabaciones emparejadas con microelectrodos sharp) con biocitina relleno, inmunofluorescencia, procedimientos histológicos y altamente detalladas reconstrucciones neuronales, lo que permite la comparación directa con los vecinos CA regiones23,24,25.

La técnica descrita en este artículo se ha desarrollado sobre los años para obtener detallada anatomía neuronal que permite la clasificación correcta de las células y la alta calidad y reconstrucciones exactas de ambos sus cenadores dendríticas y axonales, datos que pueden ser correlacionados con los datos electrofisiológicos de pares grabaciones utilizando electrodos afilados. El protocolo histológico ha sido optimizado para preservar la ultraestructura de las neuronas y excelente recuperación de dendríticas (incluyendo espinas) y cenadores del axonales. Por ejemplo, el principio de la técnica de doble fijación por inmersión en una solución fijadora en primer lugar y en segundo lugar la fijación en tetraóxido de osmio da un buen contraste para microscopia ligera26. Una pequeña cantidad de ácido pícrico solución de glutaraldehído y se agregan a la solución de fijación para mejorar la penetración de anticuerpos y para preservar la ultraestructura de las células como se sugiere en un anterior estudio27. La permeabilización de las rebanadas de cerebro utilizando el método de congelación y descongelación combinado con cryo-protección con sacarosa, más que un detergente tradicional, también ofrece una óptima preservación de los tejidos para análisis morfológico de las células registradas. Además, se mejora la visualización particular de estructuras finas muy reduciendo la tinción de fondo con las incubaciones con peróxido de hidrógeno (H2O2) y borohidruro de sodio (NaBH4). Adición de cloruro de níquel (NiCl2) a la peroxidasa de rábano (HRP) reacción para obtener un producto de reacción de pigmento negro también aumenta el contraste.

El siguiente protocolo describe los procedimientos utilizados para determinar la preservación de tejidos excelente y altamente detalladas reconstrucciones 3D neuronales tras grabaciones intracelulares en vitro. La descripción de la preparación de la rebanada, grabaciones pareadas intracelulares utilizando con electrodos y posteriores procedimientos histológicos utilizados en nuestro laboratorio han sido previamente divulgados28. Aunque el protocolo se aplica a las células llenadas intracelularmente con biocitina en rebanadas gruesas de 450 – 500 μm, el mismo protocolo puede utilizarse después de grabaciones de celulares. Sin embargo, el uso de cortes más delgados resultará en reconstrucciones menos completas de las células.

Protocolo

Todos los procedimientos utilizados en este estudio se llevaron a cabo conforme a las normas de la British Home Office en relación con el Animal científico procedimientos ley de 1986.

1. determinación de calcio Binding proteína o proteína contenido de interneuronas y visualización de biocitina siguiendo las grabaciones electrofisiológicas y relleno de biocitina

Nota: Al final de las grabaciones electrofisiológicas, láminas que contienen las células llenas de biocitina se fijan durante la noche antes de los procedimientos histológicos. La solución fijadora se reemplazará con un solo cambio de tampón fosfato de 0,1 M a la mañana siguiente, si el resto del procedimiento se lleva a cabo en otro día, con el fin de evitar daño tisular. La solución de fijación (paraformaldehído al 4%, solución de ácido pícrico 0,2% saturada, solución de glutaraldehído al 0.025% en tampón de fosfato de 0,1 M (PB)) se realizará recién en el día de las grabaciones para obtener mejores resultados.

  1. Al final de la grabación electrofisiológica, cuidadosamente recoger el segmento que contiene las celdas grabada con un pincel y colóquelo en un recipiente que contiene líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF).
    Nota: Detalles del protocolo usado para la preparación de la rebanada y grabaciones intracelulares usando electrodos agudos han sido descritos28.
  2. En una campana de humos, cuidadosamente recoger la rebanada del cerebro con un pincel y rodillo en un pequeño trozo de papel de filtro fino de la calidad. Coloque otro pedazo de papel de filtro humedecido sobre la rebanada y colocar los dos trozos de papel de filtro mojado en un bote pequeño de plástico que contiene 5-10 mL de solución fijadora y guardar en la nevera durante la noche a 4 ° C.
  3. Preparar una solución de gelatina en agua destilada. Colocar 20 mL de agua destilada en un vaso de precipitados sobre una placa caliente y calentar a 60 ° C. Añadir progresivamente 2,4 g de gelatina en el agua, esperar hasta que se disuelva y déjelo enfriar a 35 – 40 ° C antes de su uso para prevenir el daño tisular.
  4. Reemplace la solución fijadora por 2 mL de 0.1 M de PB. Coloque la rebanada en un plato de Petri y cortar cualquier exceso de tejido con una hoja de bisturí. Coloque el tejido cortado en un plato de Petri (9 cm de diámetro, altura de 1,4 cm), asegurando que se encuentra plano sin pliegues ni arrugas, quitar el exceso de tampón con un pincel seco.
  5. Cubrir el tejido con la solución de gelatina caliente y coloca la caja Petri sobre un bloque de helado para enfriar rápidamente la solución.
  6. Usando una lámpara de porte angular para proporcionar contraste, mire por el lado del plato y mantener la rodaja plana ejerciendo una ligera presión de un pincel fino hasta que la gelatina comience a establecer.
    Nota: La gelatina puede ser re-fundida si el tejido no está plano. Cualquier imperfección en la superficie de la gelatina causada por la eliminación de la brocha como se solidifica puede eliminarse por la fusión de la capa superficial suavemente moviendo la bombilla de la lámpara cerca de la superficie durante unos segundos.
  7. Mover el plato de gelatina de ajuste a la nevera y dejar a 4 º C durante 30-60 minutos.
  8. En una campana de humos, cortar un bloque pequeño (~ 1 x 1 cm) que contiene el tejido embebido en gelatina del plato con una hoja de bisturí, levante el bloque usando una pequeña espátula y colocarla cuidadosamente en la solución fijadora mismo pero fresca utilizada para fijar las rebanadas durante al menos 30 minutos a 4 ° C .
  9. Lavar el bloque de gelatina en 5 mL de 0.1 M de PB tres veces, secar con un pedazo de papel tejido y palillo del lado del bloque hacia arriba (es decir, con el tejido en la parte superior) en un vibratome chuck usando pegamento.
  10. Quitar el exceso de pegamento con un trozo de papel de filtro y use una hoja de bisturí para cortar las esquinas del bloque, dejando forma de diamante.
  11. Sección la rebanada a 50 μm de espesor con un vibratome y colocar cada sección cuidadosamente en un frasco de vidrio que contiene 10% de sacarosa.
  12. Cuidadosamente recoger una sección del frasco, coloque plana en una tapa de caja de Petri. Usando un microscopio de disección y una hoja de bisturí nueva, quite la gelatina de alrededor de la sección y retomar la sección de una frasco ampolla de 2 mL de sacarosa al 10% fresco
    Nota: Es fundamental eliminar tanta gelatina como sea posible en esta etapa para reducir el encogimiento del tejido durante la etapa de deshidratación (paso 1,37).
  13. Cryo-proteger las secciones de solución 0,1 M PB-base sacarosa-glicerol a temperatura de les incubación por 10 min en solución de sacarosa 10%, 20 minutos en solución de glicerol 20% sacarosa - 6% dos veces y finalmente 30 min en solución de glicerol 30% sacarosa - 12% dos veces bajo agitación constante.
  14. Coloque las secciones planas en un pequeño rectángulo de papel aluminio con un pincel. Retire cualquier exceso de líquido de las secciones y doblar cuidadosamente el papel aluminio en un paquete.
  15. Mantenga el paquete cerca de la superficie de nitrógeno líquido sin tocar la superficie para 30 s y luego permitir que las secciones se descongele totalmente para aproximadamente 30 s. repetición hielo-deshielo otro dos veces.
  16. Elimine todas las secciones con un pincel y colocarlos en un frasco de vidrio que contiene 2 mL de 0.1 M de PB bajo agitación constante a lave el exceso de la sacarosa.
  17. Eliminar la PB con una pipeta Pasteur e incubar las secciones en 2 mL de 1% acuosa H2O2 para 30 minutos Lávese las secciones en 2 mL de 0.1 M de PB 3 x 5 min.
  18. Quite el PB de 0.1 M con una pipeta Pasteur y agregue 1% borohidruro de sodio (NaBH4) en 0,1 M de PB.
    Nota: No tapa el frasco, como NaBH4 solución desprende gas hidrógeno.
  19. Quitar el borohidruro de sodio con una pipeta Pasteur y lavar las secciones completamente en 2 mL de 0.1 M de PB 5 x 5 min.
  20. Reemplace el PB de 0,1 M con 10% de suero normal de cabra (NGS) en PB 0.1m durante 30 minutos.
  21. Retire el suero de cabra e incubar las secciones durante la noche a 4 ° C en una mezcla de monoclonal de ratón y anticuerpos policlonales de conejo en solución de ABC.
    Nota: Una lista de los anticuerpos primarios utilizados en estudios anteriores se muestra en la tabla 1 en saboteador et al. (2014) 29.
  22. Incubar las secciones de 2 h en la oscuridad en una mezcla de anticuerpos secundarios marcado con fluorescencia (Tabla de materiales).
  23. Monte las secciones sobre las diapositivas de medio de montaje y cubrir con un cubreobjetos.
  24. Tomar imágenes del etiquetado de fluorescencia a 40 aumentos (figura 1Bb).
  25. Después de la proyección de imagen de la fluorescencia, coloque lo portaobjetos en un plato de Petri de vidrio que contiene PBS y retirar cuidadosamente el cubreobjetos. Luego lavar las secciones de la diapositiva usando pulsos apacibles de PBS de una pipeta Pasteur. Coloque las secciones en un frasco limpio de vidrio que contiene PBS.
  26. Realizar la reacción de avidina-HRP por incubación en primer lugar de las secciones en ABC durante al menos 2 h para amplificar el producto de reacción de HRP.
  27. Preparar la solución 3,5 diaminobenzidina (DAB) mediante la adición de una tableta a 5 mL de agua destilada.
  28. Lávese las secciones con PBS 3 veces durante 10 minutos y luego con Tris buffer dos veces durante 10 minutos retirar el tampón Tris después del último lavado.
  29. Rápidamente añadir una gota de solución al 8% NiCl2 a la solución de DAB, pipetear la solución dentro y fuera para mezclar y rápidamente agregue 1 mL de esta solución sobre las secciones. Incubar las secciones en la solución DAB/NiCl2 durante 15 minutos.
  30. Añadir 10 μl de 1% H2O2 a la solución de DAB. Permite la reacción en la oscuridad bajo agitación constante durante aproximadamente 1 a 2 min y vigilar el etiquetado de células rellenas con un microscopio de disección.
  31. Detener la reacción mediante la eliminación de la solución DAB/NiCl2/h2O2 y lavar las secciones con tampón Tris dos veces durante 5 minutos.
  32. En una campana de humo, coloque un pequeño círculo de papel de filtro en una placa Petri y humedézcalo con 0.1 M de PB. Levante las secciones uno a la vez de la Copa del frasco con un pincel y colocarlos cuidadosamente plana sobre el papel.
  33. Cubrir las secciones con otro círculo humedecido del papel de filtro y quite el exceso de tampón tocando suavemente el papel a la superficie.
  34. Aplicar 8 a 9 gotas 1% de tetróxido de osmio en PB 0.1m en el papel superior, cubrir el plato y retener en la campana por al menos 30 minutos, pero no más de 1 h.
  35. Abra la caja Petri y saque el papel de filtro superior. Levante cuidadosamente las secciones uno a la vez con un pincel, colocar en un frasco de vidrio y enjuagar en agua destilada dos veces.
  36. Deseche adecuadamente residuos de tetróxido de osmio. Enjuague todo el equipo disponible y colocarlos en contenedores apropiados.
  37. Colocar cada sección plana sobre un portaobjetos de vidrio y cubreobjetos los elementos. Transfiera el porta en una placa Petri, coloque un frasco de vidrio vacío sobre el cubreobjetos para retener en el lugar y la tapa con alcohol al 50%. Después de 15 minutos, quitar la corredera de la solución y retirar las secciones de la diapositiva. Lugar las secciones detrás de la diapositiva y luego coloque el portaobjetos en alcohol al 70% durante 15 minutos repetir el mismo proceso con 95% y finalmente solución de alcohol de 100%.
  38. Tras el paso de deshidratación, transferencia de las secciones a un frasco de vidrio con alcohol de 100% en una shaker en una campana de humos. Reemplazar la solución de alcohol con óxido de propileno (C3H6O) y lavar tres veces durante 5 minutos. Después del último lavado, mantener ~ 2 mL de óxido de propileno en el frasco y agregue resina (proporción 1:1). Asegúrese de que la resina se disuelve y mantener las secciones en agitación constante durante 30 minutos.
  39. Colocar cada sección en una plancha de aluminio que contienen resina epoxi usando un palo de madera e incubar durante la noche.
    Nota: No deje las secciones en la resina más de 24 h para evitar el riesgo de dañar las secciones.
  40. Lugar la plancha sobre una placa caliente durante aproximadamente 10 minutos cada uno recoger la sección con un palo de madera y colocarlos en un portaobjetos limpio. Mantener la orientación de cada sección constante utilizando un microscopio de disección. Coloque un cubreobjetos sobre las secciones. Colocar el portaobjetos en el horno durante 48 h a 56 ° C para el curado.

2. 3D reconstrucciones Neuronal

Nota: Se utiliza el software Neurolucida. Instrucciones siguientes sólo se aplican a un sistema de reconstrucción de neurona específica (Tabla de materiales). Las secciones de la corte coinciden antes de las reconstrucciones usando un microscopio.

  1. Coloque un portaobjetos sobre la platina y fije con el clip de la etapa y abra el software de reconstrucción de la neurona. Haga clic en adquirir ficha y seleccione la imagen en directo.
  2. Medir el espesor de cada sección usando 100 X objetivo de aceite. Anote el valor en el medidor de z en la parte superior e inferior de cada sección y calcular el espesor de la sección como la diferencia de los dos valores.
  3. Utilice un objetivo de bajo aumento para centrarse en la sección de Inicio que contiene el cuerpo de la célula. Usar un objetivo de 100 x, se centran en el cuerpo de la célula y haga clic en el centro para marcar el punto de referencia.
  4. En la ficha de seguimiento , seleccione Administrador de la sección de serie. Continuación, seleccione Crear nueva sección (+ icono) en la ventana de Administrador de la sección de serie . Introduzca el número de secciones. Nombre de cada sección en el orden correcto de la Z y entrar en el corte espesor medido en el paso 2.2.
  5. Para rastrear el soma en 3D con el objetivo de 100 X, seleccione contorno desde la ficha de seguimiento y el contorno del cuerpo de la célula . Use el joystick para mover el enfoque a la parte superior del cuerpo de la célula. Colocar los puntos haciendo clic alrededor del perímetro de la parte que está en foco. Con el botón derecho y seleccione Contorno cercano para terminar este primer esbozo. Repita este proceso en las posiciones z diferentes hasta alcanzar la parte inferior del cuerpo de la célula (figura 2).
    Nota: Seleccione visualizar 3D en ficha de seguimiento para visualizar el cuerpo de la célula en 3D.
  6. Para localizar el cuerpo de la célula en 2D con objetivo de 100 X, seleccione cuerpo celular en el menú de la neurona en la ficha de seguimiento foco en el centro del cuerpo celular. Colocar los puntos haciendo clic alrededor del perímetro del cuerpo celular. Para completar el cuerpo de la célula, con el botón derecho y seleccione acabado cuerpo de la célula.
  7. Para trazar el árbol dendrítico, seleccione dendrita o Dendrita Apical en el menú de la neurona . Primero trace un segmento corto, inicial de cada dendrita usando la rueda del mouse para ajustar el diámetro del cursor para que coincida con el diámetro de la dendrita. Rastro a lo largo de cada las dendritas con el joystick para moverse a través de la sección y la rueda del mouse para ajustar el diámetro del trazado.
  8. Verifique la alineación del calco con la imagen de microscopio directo y ajustar si es necesario, especialmente después de mover con el joystick. En la ficha de seguimiento , seleccione Alinear trazo, haga clic en el trazado y haga clic en la ubicación correcta.
  9. Cuando se llega a un nodo en el árbol, haga clic y seleccione Nodo bifurcarse o Trifurcar nodo desde el menú desplegable.
  10. Cuando se ha alcanzado el extremo de una rama, seleccione un final en el menú desplegable en el menú de la neurona . Seleccione el tipo de conclusión correcta, es decir., gran final, final normal o lujo terminando para facilitar el juego a través de las secciones.
  11. Reduce la magnificación en el microscopio una vez todas las dendritas en la sección actual se trazaron, seleccione la ficha Libre de la alegría y pasar a una sección que inmediatamente por encima o debajo de la sección completa.
  12. Para identificar puntos de coincidencias entre las dendritas en un tramo que coincide con la sección completa, haga clic en la ficha movimiento y seleccione puntos de partido. Seleccione el número de puntos necesarios para combinarse (tres o más puntos se prefiere) y pulse OK. Haga clic en el final de una rama completa y haga clic en la rama. Repita esto para cada punto de fósforo. Repita este proceso con 100 aumentos para emparejar exacto.
  13. Añadir ramas correspondientes a la sección anterior directamente haciendo clic derecho en la conclusión. Seleccione Agregar al final cuando la rama se alinea con la rama trazado completo y rastro según se describió anteriormente.
  14. Una vez que se trazaron todas las dendritas de cada sección, trace el axón usando el mismo proceso mediante la selección de Axon en el menú de la neurona .
  15. Ir a la sección de Inicio , vuelva a alinear la reconstrucción con la imagen de microscopio directo y seleccionar contornos de la ficha trazas seleccionar un borde de frontera o región previamente definidos contorno/capa y haga clic en seguimiento a lo largo de un contorno. Seleccione contorno abierto final. Seguimiento de todas las capas deseadas y contornos de la región.
  16. Utilizar visualizar 3D en ficha de seguimiento para visualizar las reconstrucciones en 3D.
  17. Grabar vídeos de reconstrucciones 3D (Video 1), abrir la reconstrucción 3D y abrir crear películas. Establecer un destino de archivo y velocidad de rotación deseada. Se recomienda para establecer el giro en 270°. Seleccione iniciar la grabación, registro durante unos segundos, luego haga clic en rotar automáticamente. Seleccione detener la grabación cuando sea necesario. Editar el vídeo con un software (Tabla de materiales) de edición de vídeo.
  18. Para exportar los archivos en archivos JPEG o Tiff, seleccione archivo | De exportación | Seguimiento de la exportación como imagen. Elija una proporción de μm/píxeles y seleccione ajuste. Seleccione un color de fondo y seleccione el archivo. Nombre del archivo, seleccione Tiff o JPEG y pulse Guardar. Para exportar los archivos en archivos vectoriales, seleccione archivo | De exportación | Seguimiento de exportación como los archivos vectoriales.
  19. Utilizar un software de análisis de reconstrucción de la neurona para realizar análisis morfométrico.
    1. Para analizar los árboles dendríticos y obtener un dendrograma, abra el archivo en el explorador de Neurolucida. Seleccione analizar | Estructura y seleccione dendrograma en el menú desplegable (figura 3).
    2. Para realizar un análisis integral morfométricas de las reconstrucciones 3D (rama complejidad, volúmenes de ramas y somas, superficie), abra el archivo en el software. En la ficha Ver , haga clic en seleccionar todo. Seleccione la pestaña analizar . Continuación, seleccione estructura y Análisis de la estructura de rama.

3. resolución de problemas

  1. Cambiar ajustes de la cámara. Para mejores resultados, ajuste el tiempo de exposición a menos de 100 ms y ganancia y offset a 0 posible.
  2. Si el software de reconstrucción de neurona no muestra automáticamente los contornos trazados como un cuerpo de célula 3D en 3D visualizar en la ficha de seguimiento , seleccione seleccionar objetos en la ficha de seguimiento , mantenga pulsada la tecla Ctrl en el teclado y Haga clic en todas las lineas, haga clic derecho y seleccione Set cuerpo celular en el menú desplegable.
  3. Para ajustar los parámetros z de un rama individual, seleccione el árbol (seleccionar objetos en la ficha de seguimiento ) y ajuste el ajuste de la z de todos los puntos mediante el menú contextual desplegable. Seleccione modificar posición de z, entonces z valor de cambio y entrar el valor deseado.
  4. Realinear las reconstrucciones con 'Ir a' en la pestaña de ' mover' cuando es necesario moverse una gran distancia sobre el trazo.
  5. Agregar nodos adicionales en cualquier momento durante el proceso de reconstrucción. Seleccione la sucursal donde el nodo debe ser colocado en (Seleccionar objeto en la ficha de seguimiento y haga clic en la rama), clic derecho y seleccione Insertar nodo en el árbol seleccionado. Haga clic en la ubicación correcta en la rama.
  6. Cuando la reconstrucción de un complejo neurona, trace ramas correspondientes individualmente y después de empalme para su más fácil identificación de ramas. Rastrear las ramas en la nueva sección individualmente y luego instale estas ramas a las ramas correspondientes en la sección anterior revoloteando sobre el final de la rama para empalmar, clic derecho y seleccionar empalme, luego cierne sobre el final que la rama es empalmar a y haga clic en.
  7. Si una rama se remonta según el tipo de árbol malo, seleccione el árbol, haga clic en Cambiar el tipo de árboly seleccione Seleccione el tipo de árbol correcta.
  8. Si un punto se coloca incorrectamente, hacer Ctrl + Z, o haga clic en el botón de Deshacer en el menú Trace para eliminar el último punto. Sin embargo, este procedimiento no funcionará si se usa el joystick para moverse a través de la sección antes de intentar quitar un punto. En este caso, el punto puede eliminarse cuando la rama se terminó. Seleccione la rama (prensa Seleccionar objeto y haga clic en la rama), pasa el cursor sobre el punto para eliminarse, haga clic derecho y seleccione quitar punto.
  9. Si no está seguro que si se emparejan dos ramas, ya sea 1) Utilice 3D visualiza en ficha de seguimiento para comprobar si las ramas coinciden en el plano z, o 2) utilizan la función Mostrar acompañamiento en la sección administrador de serie para mostrar las secciones inmediatamente arriba y debajo de la sección actual en gris.
  10. Si se gira una sección, vaya a herramientas en la ficha de seguimiento seleccione Ajustar escala XY y cambiar el eje x en -1. Luego seleccione Z-contracción correcta y cambiar eje z-1. Entonces trazar ramas como de costumbre. Recuerde invertir estos cambios al pasar a una sección que tenía la orientación original. Cambiar los ejes x e z - no cambio rama poner fin a las etiquetas, así que tenga cuidado al empalme que se utilizan las terminaciones correctas.
  11. Z-contracción correcta puede ser corregida, si hay una diferencia significativa entre la sección de corte grueso y el grueso montado mide. En la ficha de seguimiento , seleccione herramientasy luego corregir Z-contraccióny entrar en el factor de reducción para el eje z como una representación decimal del espesor de corte dividido por el espesor montado.

Resultados

Las neuronas hippocampal CA2 se llenaron de biocitina siguiendo las grabaciones electrofisiológicas (figuras 1Ac, Ad y 1Bc, Bd). Los cortes fueron fijados durante la noche después de las grabaciones y la neuroquímica y la caracterización morfológica de las neuronas fueron revelados siguiendo el protocolo descrito aquí.

La proteína de unión a calcio o proteína contenido de interneuronas llenadas determinó incubando las rodajas primero con anticuerpos primarios y luego con fluorescencia con anticuerpos secundarios. Las características de disparo de las interneuronas durante las grabaciones determinará la elección de los anticuerpos primarios utilizados. Avidina-AMCA fue utilizado para visualizar la interneurona lleno de biocitina e isotiocianato de anti-ratón fluoresceína (FITC) y cabra anti-conejo Texas rojo (TR) fueron utilizado para caracterizar la neuroquímica interneuronal (figura 1Bb).

Tras la visualización de la fluorescencia, se utilizó un protocolo HRP para revelar la biocitina (figura 1Ab). La fina anatomía detallada del CA2 interneuronas entonces fue dibujada en 3D mediante un software de reconstrucción de la neurona (figura 2 y figura 3a). Un video de una reconstrucción 3D de una célula de la cesta registrados y lleno en CA2 se muestra en el Video. Reconstrucciones neuronales eran consideradas como completa si los cenadores dendríticas y axonales fueron confinados dentro de la profundidad de la rebanada de 450-500 μm. Coloración pobre arbor axonal se evaluó por la presencia de ramas truncadas con finales abiertos en la parte superior o inferior de la rebanada o por una tinción que se limitaba al segmento inicial del axón y ramas muy proximales. Figura 4 representa los ejemplos de una buena y una mala HRP tinción siguientes biocitina visualización.

Análisis morfométrico de reconstrucción 3D (figura 3) pueden llevarse a cabo para demostrar la complejidad rama, superficie de soma y el área superficial y volumen de los cenadores dendríticas y axonales.

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Figura 1 : Reconstrucciones neuronales de dos tipos de células de cesta grabado y rellena la región hippocampal de CA2 y correlacionaron datos electrofisiológicos obtenidos tras grabaciones intracelulares en vitro. Esta figura se ha modificado del anterior estudios23,24. TAL estrato Oriens, SP estrato Pyramidale, SR estrato Radiatum, SLM estrato Lacunosum Moleculare. (A) Aa: reconstrucción de una célula de la cesta de CA2 con restringido cenador dendrítico y axonal mediante un tubo de dibujo (1000 X). Las dendritas son en negro, y el axon es en rojo. AB: Imagen de la célula de la cesta llena de biocitina siguiendo el protocolo de avidina-HRP se describe aquí. AC: Rastro representativo de las respuestas de tensión hiperpolarizantes y despolarizantes inyección actual de una célula de la cesta de CA2 con cenador dendrítico y axonal restringido. Anuncio: Ejemplo de una pirámide de CA2 para restringir las conexiones de células de cesta arbor grabado utilizando electrodos afilados. Compuesto potencial poste-sináptico excitatorio (EPSP) promedios muestran tren breve depresión aparente durante las respuestas a los trenes de tres espigas. (B) Ba: reconstrucción 2D de una célula de la cesta de CA2 con cenadores ancho dendríticas y axonales mediante un tubo de dibujo (1000 X). El árbol dendrítico de esta célula de la cesta (en negro) extendido radialmente a través de todas las capas de la región CA2 y horizontalmente en SO y SP de las regiones CA2 y CA3. Una dendrita horizontal también llegó a la región CA1. El axón (en rojo) extendido a las regiones CA3 y CA1. BB: La llena de biocitina (AMCA tinción) célula cesta era PV-immunopositive (tinción FITC) y CB-immunonegative (tinción roja de Texas). BC: Rastro representativo de las respuestas de tensión hiperpolarizantes y despolarizantes inyección actual de una célula de la cesta de CA2 con eje ancho dendrítica y axonal. BD: Medias de EPSP compuesto muestran breve tren facilitación aparente durante las respuestas a los trenes de tres espigas. Pueden encontrarse ejemplos de otros tipos de interneuronas en CA2 en anteriores estudios25,30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

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Figura 2 : Reconstrucción 3D de la célula de cuerpo. (A) rastreo 3D del cuerpo celular. Vista de los diferentes contornos trazada en las posiciones z diferentes mientras que el enfoque a través del cuerpo celular. (B) vista 3D de los diferentes contornos. (C) vista 3D del cuerpo de la célula en un ángulo diferente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

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Figura 3 : Análisis de la morfometría de reconstrucciones 3D de neuronales. (A) reconstrucción 3D de una célula de la cesta de eje estrecho CA2. Cada rama dendrítica es representado por un color (verde, azul, rojo y rosa) y axón está en azul claro. Dendrograma (B) de la célula de la cesta que representa el número de ramas dendríticas y la longitud de cada segmento dentro de esferas concéntricas con el soma y en intervalos de 100 μm de soma. Los colores en el dendrograma corresponden a los de las dendritas en a. (C) ejemplo de análisis morfométricos realizado en células piramidales de CA2 (adaptadas de un anterior estudio23). El número de ramas dendríticas se enfrenta a la distancia desde el soma de las células piramidales de CA2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

figure-results-4
Figura 4 : Ejemplos de coloración buena (A) y pobre (B) HRP. (A) recuperación de biocitina reveló una interneurona muy bien llena en CA2. El cuerpo de la célula (CB) se tiñe de oscuro y tiene contornos claros. Las dendritas son cuentas y muestran algunas espinas (representados por estrellas rojas). El eje axonal (A) es denso y presenta pequeños botones. (B) ejemplo de una pobre tinción dendrítica y axonal de las células piramidales 2 en CA2. La tinción de la CB es débil con ningún contorno claro. Coloración pobre suele estar asociada con las grabaciones electrofisiológicas más cortas que en presencia de muy pocas ramas llenas de biocitina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Video 1: 3D reconstrucción neuronal de una célula de la cesta de CA2 con cenador dendrítico restringido (también conocido como célula de la cesta de eje estrecho CA2) con su soma en pyramidale del estrato, dendritas que abarca todas las capas y axon pyramidale del estrato de CA2 y oriens estrato adyacente y radiatum. Muy pocas ramas alcanzaron el proximal CA3 estrato oriens y pyramidale del estrato de CA3. Esta celda se llenó de biocitina siguiendo las grabaciones electrofisiológicas y las secciones fueron procesadas con avidina-HRP siguiendo el protocolo descrito aquí. Debido a la corte, sólo el axón dentro de la profundidad de la rebanada se recuperó, aunque las dendritas están intactas. Las dendritas son en rosa oscuro y axon en blanco. Límites de la capa y la región se han añadido al principio del video. Reconstrucción 3D en vídeo 3D-Economides de Georgia por Svenja Falk. El video fue grabado con un software de reconstrucción de la neurona en paso 2.17 y editado con un software de edición de vídeo. Enlace al video:30. Haga clic aquí para descargar este video.

Soluciones utilizadasComposición/instrucciones
Solución de fijaciónparaformaldehído al 4%, 0.2% saturada de ácido pícrico solución, solución de glutaraldehído al 0.025% en tampón de fosfato de 0,1 M (PB)
0.1 M tampón fosfato pH 7.6Añadir 100 mL de caldo 1 M fosfato tampón a 900 mL de agua destilada
Fosfato tampón salino pH (PBS) / 7.5 7.4Añadir 10 mL de tampón de fosfato de 0,1 M, 0,2 g de KCl y 8,76 g de NaCl a 990 mL de agua destilada
Tampón TRIS, pH 7,5Disolver 5,72 g de Tris hidrocloruro y 1.66 g de Tris Base en 50 mL de agua destilada. Luego realizar hasta 1 L con agua destilada.
Solución fijador glutaraldehido y paraformaldehidoparaformaldehído al 4%, 0.2% saturada de ácido pícrico solución, solución de glutaraldehído al 0.025% en tampón fosfato de 0,1 M.
Solución de ABCSolución a por lo menos 30 minutos antes de usar el kit de ABC. Añadir 1 gota de solución A y 1 gota de solución B a 2,5 mL de PBS.
Durcupan resina de epoxy:Para hacer 20 ollas: 20 g de componente A, 20 g de componente B, 0,6 g de componente C y 0,4 g de componente D -
Proteger el equilibrio de derrames cubriendo la placa con un círculo de papel de filtro. Pesar cuidadosamente los reactivos en un vaso de tripour en las proporciones indicadas. Mezclar bien agitando vigorosamente usando dos palillos de madera durante al menos 5 minutos. La mezcla debe quedar un color marrón oscuro de densidad uniforme. Coloque el recipiente en el horno a 50 ° C durante un máximo de 10 minutos para eliminar todas las burbujas de aire como sea posible. Nota: La resina comienza a curar si dejar el recipiente en el horno más de 10 minutos decantar la resina en macetas de plástico o jeringas de 5 mL, fecharlos y almacenar en el congelador de-20 ° C listo para su uso.

Tabla 1: Tabla de soluciones. 

Discusión

Las grabaciones electrofisiológicas en vitro (figura 1 CA,d y A.c., d) combinada con histoquímica y procedimientos de inmunohistoquímica permiten la morfología detallada, el contenido de proteína de unión de calcio y identidad de interneuronas corticales adultos registrados para ser revelado. En la región CA2, esta técnica permite el estudio de los circuitos locales por primera vez y reveló las subclases de interneuronas que no habían sido descritos previamente en CA1 o CA3: células de cesta de eje ancho dendrítica y axonal (figura 1B), las células bistratified y interneurons SR SP.

El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para preservar la ultraestructura de las neuronas y excelente recuperación de dendríticas (incluyendo espinas) y cenadores del axonales. Pasos críticos incluyen el uso de la técnica de doble fijación para mejorar contraste para microscopia ligera26 y la adición de solución de glutaraldehído y ácido pícrico para la solución de fijación para mejorar la penetración del anticuerpo y preservar la neuronal ultraestructura de27. Permeabilización de hielo-deshielo apacibles da mejor preservación de estructura fina, mientras que la incrustación de resina y osmication reducen la contracción del plano z28. Además, se mejora la visualización de muy fino (finos axones con pequeños botones por ejemplo) por incubación de las secciones con H2O2 y NaBH4 para reducir la tinción de fondo. Contraste puede también incrementarse con la adición de NiCl2 a la reacción de HRP.

El procedimiento histológico detallado aquí ofrece excelentes resultados en términos de reproducibilidad y confiabilidad. Sin embargo, la duración de las grabaciones electrofisiológicas determinará la calidad de la biocitina/fluorescencia coloración, con grabaciones más cortas generalmente asociadas con pobre tinción axonal. También puede influir en la opción de registro de protocolos (grabaciones intracelulares utilizando electrodos afilados vs celulares parche de sujeción) biocitina retención y preservación de la anatomía fina.

Mientras que las dificultades en preservar estructura fina durante el procesamiento histológico se describen aquí y el tiempo necesario para reconstruir en un aumento de 100 X (1-4 semanas dependiendo de la complejidad del axón) se aprecia, este método da una representación precisa del diámetro axonal y dendrítica. El uso de menos exigentes protocolos para revelar etiquetado biocitina es comprensible, sin embargo, estos a menudo impiden una visualización clara de finas ramas axonales. Detergentes, para promover la entrada de avidina-HRP para revelar la biocitina y anticuerpos, suelen ser necesarias en secciones gruesas, pero pueden perturbar la estructura fina. Neurocientíficos buscar constantemente métodos semiautomáticos de la reconstrucción, pero, por ahora y para axones especialmente, biocitina-HRP con reconstrucción manual sigue siendo el estándar de oro31.

Altamente detallada reconstrucción neuronal, especialmente precisos dibujos de boutons axonales y nodos, la presencia o ausencia de mielina y en general el dibujo de arbor axonal completa, con la representación de diámetro de axón exacta cambia a lo largo de su longitud, proporcionar información para la identificación precisa de un tipo distinto de interneurone adicional. Aunque muchos interneurons no se ajusten exactamente a una clase específica, la técnica descrita anteriormente proporciona datos correlacionados en propiedades electrofisiológicas neuronales, la plasticidad a corto plazo asociados con un tipo específico de conexión y detallada reconstrucciones neuronales, que permite el esquema, en la región CA2, por ejemplo, para estudiar en detalle.

Fina y detallada de la estructura se simplifica a menudo en modelos computacionales. Aunque comprensible, esto resulta en la pérdida de la información que podría resultar crítico en el futuro. Análisis de reconstrucciones 3D detalladas con datos sinápticas en paralelo permite la adición de más criterios de clasificación interneuronal. Datos pueden ser depositados en repositorios públicos y utilizados por modelistas para explorar el resultado de los cambios esporádicos en diámetro del axón y myelination en potencial de acción propagación de cómputo.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación ha recibido financiación de Novartis Pharma (Basilea) y el Consejo de investigación médica otorgado a Prof Alex Thomson, la biotecnología y de biológico Ciencias Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), la Physiological Society, la Unión Europea Horizonte 2020 programa marco de investigación e innovación bajo el acuerdo de subvención específica núm. 720270 (cerebro humano proyecto SGA1) y bajo el acuerdo de subvención específica núm. 785907 (cerebro humano proyecto SGA2). Estamos muy agradecidos a Prof Alex Thomson para configurar el protocolo en otras regiones corticales, asegurar fondos y por su continuo apoyo para este proyecto. Se agradece aportes de miembros del laboratorio que ayudaron a optimizar el protocolo de recuperación y reconstrucción las neuronas CA2: Deuchars J. H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo de ácido avidina-7-amino-4-metilcumarina-3-acético (Avidin-AMCA): 20,8 mg/mL Laboratorios de vectoresA2008
Biocytin  ≥ 98% (TLC)SigmaB4261
3,5 diaminobenzidina (DAB) tableta, Para preparar 5 mLSigmaD4293
Resina epoxi Durcupan ASigma44611
Resina epoxi Durcupan BSigma44612
Resina epoxi Durcupan CSigma44613
Resina epoxi Durcupan DSigma44614
Etanol, puriss. p.a., absoluto, ≥ 99,8 %Sigma32221
GelatinaSigma48723
Solución de glutaraldehído, grado I, 25 % en H2OSigmaG5882
Glicerol, ≥ 99% SigmaG5516
Suero de cabraSigmaG9023
Isotiocianato de fluoresceína anti-ratón de cabra (FITC)- 14,3 mg/mLSigmaF2653
Cabra anti-conejo Texas Red (TR)- 3,3 mg/mLInvitrogenT2767
Peróxido de hidrógeno, solución al 30%SigmaH-1009
inmersión, viscosidad 1.250 cSt (lit.)SigmaI0890
Cloruro de níquel (NiCl2 . 6H2O)Sigma N5756
Tetróxido de osmio, para microscopía electrónica, 4% en H2O Sigma75632
Paraformaldehído, grado reactivo, cristalino SigmaP6148
Ácido pícrico, humedecido con agua, ≥ 98%Sigma197378
Tampón de fosfato 1 MSigmaP3619
Óxido de propileno (C3H6O), 99%Alfa Aesar 30765
Tetrahidroborato de sodioVWR27885.134
SacarosaFisher scientificS/8600/53
Clorhidrato de Trizma, ≥ 99.0%SigmaT5941
Trizma base, ≥ 99.9%SigmaT6066
Vectashield Medio de montaje antidecoloración, , índice de refracción 1.45 Laboratorios de vectoresH-1000
Vectastain Elite ABC HRP kit Laboratoriosde vectoresPK6100
Equipos utilizados 
VibratomeAgar Scientific
C4A Planchetas de aluminio ahuecadas GA-MA & ASOCIADOS, INC.
Microscopio Leica DMR Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  fuente de luz fluorescente Tecnologías Excelitas 
Cámara de microscopio digital Leica DFC450 Leica Microsystems 
Bolígrafo de dibujo técnico Rapidograph 0.18mm gráfico de Londres
0,18 mm plumín rapidographcentro
Bolígrafo de dibujo técnico rapidograph 0,25 mm gráfico de Londres
Plumín rapidógrafo de 0,25 mmCentro
Sistema Neurolucida que incluye estación de trabajo para PC, escenario, cámara y joystic para el control de escenario XYZMicrobrighfield (MBF) Bioscience
Versión de software Neurolucida 2017Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelSuite de gráficos DRAW X5Corel
Software de edición de video Adobe Premiere Pro
Viales de vidrio 14 mLFisher scientific 
Aceite deCentro gráfico de LondresCentro gráfico de Londres

Referencias

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