Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico

Resumen

Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.

Resumen

Existe un creciente interés en líquido biopsia para el diagnóstico de cáncer, el pronóstico y el seguimiento terapéutico, creando la necesidad de marcadores biológicos confiables y útiles para la práctica clínica. Aquí, presentamos un protocolo para extraer, retroceso transcribir y evaluar los niveles de expresión de miRNAs de muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal (CCR) de circulación. microRNAs (miRNAs) son una clase de RNAs no codificantes de 18-25 nucleotides en longitud que regulan la expresión de genes diana a nivel traduccional y juegan un papel importante, incluyendo el de la función de pro - y anti-angiogénicos, en la fisiopatología de varios órganos. miRNAs son estables en fluidos biológicos como el suero y el plasma, que los hace ideal circulación biomarcadores para cáncer diagnóstico, pronóstico y tratamiento la toma de decisiones y monitoreo. Extracción de miRNA de circulación se realizó mediante un método rápido y eficaz que consiste en métodos orgánicos y basados en la columna. Para miRNA retrotranscripción, se utilizó un procedimiento de múltiples paso que considera poliadenilación en 3' y la ligadura de un adaptador a 5' de los miRNAs maduros, seguido de pre-amplificación miRNA al azar. Seleccionamos un panel personalizado 24-miRNA a prueba por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y vistos los sondeos miRNA en placas personalizadas de matriz. Se realizaron carreras de placa de qRT-PCR en un sistema de PCR en tiempo real. Limpieza miRNAs de normalización fueron seleccionados utilizando el software GeNorm (v. 3.2). Los datos se analizaron utilizando el software de la suite de expresión (v 1.1) y se realizaron análisis estadísticos. El método demostró para ser confiable y técnicamente robusto y puede ser útil para evaluar los niveles de biomarcadores en muestras líquidas como el plasma o suero.

Introducción

CRC representa la tercera más frecuentemente diagnosticada la malignidad y la cuarta causa de muerte relacionada con cáncer en todo el mundo. Hasta la fecha, (B) el bevacizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y (C) el cetuximab o panitumumab (P), anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), han sido aprobados para tratamiento de primera línea en combinación con regímenes de quimioterapia (CT).

Las mutaciones en los genes K-ras y N-RAS son los biomarcadores clínicamente útiles sólo capaces de identificar pacie....

Protocolo

Nota: Realizar todos los pasos siguientes bajo una campana de humos esterilizados según buenas prácticas de laboratorio (BPL).

1. almacenamiento y recogida de plasma

1. Recoger 3 mL de muestra de sangre periférica en un tubo de EDTA K3E.
2. Centrifugar el tubo a temperatura ambiente en 1.880 x g durante 15 minutos.
3. Recupera el plasma sobrenadante en alícuotas de 450 μl.
4. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso.
   Nota: Proceso del tubo de sangre periférica dentro de las 2 h de colección. Cuando se recupera el plasma del tubo, no molestes a la capa de linfocito....

Resultados

Hemos analizado un panel de miRNAs circulantes relacionados con la angiogénesis en relación con la supervivencia libre de progresión (PFS), general supervivencia y respuesta objetiva tarifa (ORR) en un mCRC 52 pacientes tratados con base B CT. La evaluación de estos biomarcadores en muestras de plasma es un reto debido a dificultades técnicas. Utilizamos métodos establecidos para la extracción de miRNA de las muestras de plasma paciente, transcripción inversa y amplificación previa. Sigui.......

Discusión

miRNAs son pequeños no-codificación RNAs (18-25 nucleotides en longitud) capaces de atar la región 3' UTR de su objetivo de ARN mensajero e inhibiendo o lo degradantes. Así se pueden considerar los reguladores de expresión génica a nivel traduccional. En la última década, varios miRNAs se han correlacionado con cáncer iniciación y desarrollo, haciéndolos útiles biomarcadores clínicos para el diagnóstico, pronóstico y terapia. Protegido por RNasas, miRNAs están presentes en una forma estable en fluidos biológicos como san.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos sin arnasa Safe-lock de 1,5 mL	Eppendorf	0030 123.328
Tubos sin arnana Safe-lock 2 mL	Eppendorf	0030 123.344
Sin arnanasa 20 µ L puntas	Starlab	S1123-1810
Sin arnanasa 200 µ L puntas	Starlab	S1120-8810
Sin ARNasa 1.000 µ Consejos en L	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS Kit de purificación de ARN y proteínas nativas	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Kit avanzado de síntesis de ADNc de miARN	Thermo Fisher	A28007
100% etanol anidro grado ACS	Reactivos Carlo Erba	414605
2-mercapto-etanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Sistema de PCR en tiempo real	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 y micro; L pipetas de
Microcentrífuga
Vortex
Bloque
Campana extractora
de 0,2 mL Tubos de

laboratoriode sobremesacalefactor de sobremesa PCR