Artículo de método

Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

DOI:

10.3791/58621

⸱

7 de enero de 2019

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1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, School of Medicine, 2Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

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El objetivo de este protocolo es identificar las poblaciones de células endoteliales linfáticas dentro del hígado usando marcadores descritos. Utilizamos colagenasa IV y DNasa y un picado suave del tejido, combinado con citometría de flujo, para identificar una población diferente de células endoteliales linfáticas.

Resumen

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En el hígado, los vasos linfáticos se encuentran dentro de la tríada portal, y su función es eliminar líquido intersticial desde el hígado a los ganglios linfáticos donde detritos celulares y antígenos pueden ser examinados. Estamos muy interesados en la comprensión de cómo puede participar la vasculatura linfática en inflamación y función de las células inmunes en el hígado. Sin embargo, muy poco ha publicado establecer protocolos de digestión para el aislamiento de las células endoteliales linfáticas (LECs) desde el hígado o los marcadores específicos que pueden utilizarse para evaluar hígado LECs de forma por la célula. Por lo tanto, hemos optimizado un método para la digestión y la coloración del hígado con el fin de evaluar la población de la LEC en el hígado. Estamos seguros de que el método descrito aquí será útil para la identificación y aislamiento de LECs de hígado y fortalecerá nuestra comprensión de cómo LECs responden al microambiente hepático.

Introducción

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No se comprende bien el papel de los vasos linfáticos y LECs en el hígado. Mientras que los vasos linfáticos se encuentran dentro de la tríada portal del hígado1 y durante la enfermedad2, muy poco se entiende sobre la función y el fenotipo de LECs dentro del hígado. Con el descubrimiento de marcadores que se encuentran principalmente en el LECs3, la importancia de estas células dentro de nichos de diferentes tejidos en homeostasis y enfermedad llenará un vacío importante en nuestro entendimiento. LECs tienen un papel importante en mantener la tolerancia periférica en los ganglios linfáticos y en los tumores metastáticos interactuando directamente con T las células4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs en los ganglios linfáticos pueden promover inmunidad protectora a través de sus interacciones con las células dendríticas migratorias14,15,16. Por lo tanto, hay múltiples funciones de LECs que pueden ser específicos de los tejidos y las interacciones en que están presentes. Sin embargo, muy poco se entiende sobre cómo interactúan con las células inmunes en el tejido los LECs o funcionan de LECs en diferentes órganos; por lo tanto, evaluar LECs en una base por células en el hígado u otros órganos puede conducir a avances en cómo LECs programa inmunidad específica de tejido. Mientras que mucha de la literatura que se centra en el LECs en el hígado utiliza la microscopia visualizar LECs con uno o dos marcadores y morfología17, muy poco se ha hecho para evaluar específicamente LECs en una base de la célula por célula mediante citometría de flujo, aunque un estudio evaluar las diferencias entre las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSECs) y LECs18. Poder analizar las poblaciones de la LEC en el hígado mediante citometría de flujo permite el estudio en profundidad del fenotipo de la LEC durante la homeostasis normal o enfermedad.

Para evaluar el LECs por citometría de flujo, se necesitan múltiples marcadores de superficie. Por lo general, LECs son visualizados por la expresión de homeobox relacionado con prospero 1 (Prox 1), receptor del recipiente linfático hyaluronan endotelial 1 (LYVE1) o factor de crecimiento endotelial vascular del receptor 3 (VEGFR3) mediante microscopía. Sin embargo, en el hígado, la expresión de estos marcadores no se limita a LECs. Prox-1 se expresa ampliamente por los hepatocitos durante el desarrollo del hígado, regeneración y lesiones19, y LYVE1 y VEGFR3 son expresados por las células endoteliales sinusoidales del hígado18. En los ganglios linfáticos, el LECs se identifican mediante citometría de flujo como racimos de diferenciación (CD) CD45 - CD31 + y podoplanin + (PDPN)16. Sin embargo, este enfoque es también mínimo para aislar LECs en el hígado, ya que las células CD45 - CD31 + capturará las células endoteliales, y la población predominante de las células endoteliales vasculares en el hígado es LSECs. Así, se necesitan otros marcadores para distinguir la rara población de LEC de la abundante población de LSEC. CD16/32 (expresado por maduros LSECs18) y CD146 (un célula endotelial vascular marcador común que es predominantemente expresada dentro de los sinusoides del hígado por las células endoteliales sinusoidales del hígado20 con poca o ninguna expresión por linfático las células endoteliales21) fueron marcadores de candidato.

Por lo tanto, hemos optimizado un método para aislar y visualizar LECs en el hígado utilizando los anteriores marcadores, CD45, CD31, CD146, CD16/32 y PDPN para citometría de flujo. Describimos el uso de colagenasa IV, DNasa 1 y separación mecánica para la digestión del tejido del hígado en una suspensión unicelular. También describimos el uso de iodixanol gradiente de densidad para el aislamiento de células no parenquimatosas (NPC) y para eliminar desechos celulares. Por último, uso de marcadores múltiples, determinar la estrategia bloquea de citometría de flujo óptimo para identificar LECs del hígado con PDPN como el marcador predominante.

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Protocolo

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) del Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus.

1. preparación de los materiales

  1. Hacer una solución de 5 mg/mL de DNasa I en tampón fosfato salino (PBS).
  2. Hacer una mezcla de digestión mediante la adición de 5.000 U/mL de colagenasa IV a los medios de comunicación EHAA haga clic en el.
  3. Caliente la mezcla de digestión a 37 ° C por 30 min antes de usar.
  4. Hacer un buffer de aislamiento añadiendo 4.8% albúmina de suero bovino (BSA) y 2 mM dihidratada del ácido (EDTA) a Hanks equilibrada solución de sal (HBSS).
  5. Hacer un buffer de lisis de glóbulos rojos (gr) mediante la adición de cloruro de amonio 100 mM, 10 mM KHCO3y 0.1 mM EDTA al agua destilada H2O.

2. preparación de una suspensión unicelular de un hígado de ratón

  1. Eutanasia el ratón con CO2 y la dislocación cervical.
  2. Aerosol hacia abajo el ratón con etanol al 70% para humedecer su piel. Pin el ratón patas para una mesa de disección.
  3. Con unas tijeras de disección para cortar la piel 1 cm arriba del ano, teniendo cuidado de cortar sólo a través de la piel (aproximadamente 1 mm). Tire de la piel del cuerpo con pinzas dentadas e inserte las tijeras entre la piel y el peritoneo. Abrir las tijeras para separar la piel del peritoneo y, luego, cortar la piel de la incisión en el cuello.
  4. Perno de la piel a la Junta de disección utilizando un perno debajo de cada brazo y encima de cada pata. Levante el saco peritoneal y corte hacia arriba hacia el cuello. Los lóbulos del hígado del gancho agarrador y corte justo debajo del esternón.
    Nota: Debe tenerse cuidado si alguno del hígado se utiliza para inmunohistoquímica (IHQ).
  5. Cortar alrededor del hígado y retire el hígado del ratón y colocarlo en 4 mL de medio de EHAA haga clic en el.
  6. Con un bisturí, cortar el hígado en ~ 1 mm de diámetro.
  7. Añadir 500 μl de la mezcla de digestión y 500 μl de la DNasa I (2 mg/mL) para el hígado.
  8. Incubar el hígado durante 30 min a 37 ° C. Después de 15 minutos, mezcle el líquido con una pipeta de 5 mL.
  9. Después de 30 min de incubación, transferir la muestra digerida a través de un tamiz de 100 μm a un tubo cónico de 50 mL.
  10. Empuje suavemente las piezas restantes a través del filtro con el émbolo de una jeringa de 1 mL.
  11. Lavar el filtro con 5 mL de tampón de aislamiento y empuje suavemente el tejido a través de la coladera con la parte posterior de un émbolo de una jeringa de 1 mL. Repetir este proceso hasta que el filtro se lava con 25 mL de tampón de aislamiento.
  12. Centrifugar las células a 400 x g por 5 min aspirar cuidadosamente apagado el sobrenadante.
  13. Resuspender el precipitado con 4 mL de tampón de lisis RBC. Incube las células a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  14. Lavar las células con 10 mL de tampón de aislamiento y centrifugar a 400 x g durante 5 minutos.
  15. Contar las células en un hemocitómetro para determinar el recuento completo de hígado.
  16. Resuspender las células en 5 mL de 20% iodixanol y capa con 1 mL de PBS.
  17. Centrifugar las células a 300 x g durante 15 min sin freno.
  18. Sacar la capa entre el PBS y el iodixanol y, a través de un filtro de 100 μm, en un nuevo tubo cónico de 50 mL.
  19. Lavar las células con 10 mL de tampón de aislamiento y centrifugar a 400 x g durante 5 minutos.
  20. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 500 μl de PBS con 2% de suero bovino fetal (FBS).

3. flujo cytometric del análisis de las células del hígado

  1. Contar las células usando un hemocitómetro y microscopio, mediante exclusión del azul tripán para medir células viables. Añadir 10 μl de las células a 10 μl de azul tripán y colóquelos inmediatamente en un hemocitómetro y contar las células vivas (no azules) bajo un microscopio. Luego, calcular el número de células por microlitro.
  2. Alícuota aproximadamente 5 millones de las restantes células de nonparenchymal en un único pozo de una placa de 96 pocillos.
  3. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 minutos.
  4. Deseche el sobrenadante y resuspender las células en 90 μl de PBS con 2% FBS.
  5. Añadir anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) y PDPN (1: 200) diluido en 10 μl de 10 x 2.4G2 o anti-CD16/32 (1: 200).
    Nota: Ningún bloque Fc (2.4G2) fue utilizado cuando se utilizó el anticuerpo anti-CD16/32-labeled.
  6. Para determinar donde se deben establecer puertas positivas y negativas, incluyen una fluorescencia menos una mancha (FMO) para cada color y un anticuerpo control de isotipo.
  7. Para determinar en comparación con las células muertas, manchas con un marcador de viabilidad (p. ej., fantasma rojo 780). Incube las células a 4 ° C durante 30 minutos.
  8. Lavar las células con 100 μl de PBS con 2% FBS.
  9. Utilice una pequeña alícuota de células para ajustar los parámetros del láser y la compensación en el citómetro de flujo. Se tiñen las células con un anticuerpo para cada fluoróforo individual y sin ningún anticuerpo.
    Nota: Según el citómetro de flujo se utiliza, debe establecerse una matriz de compensación para eliminar el solapamiento espectral.
  10. Coloque el tubo de muestra en la sonda de citómetro y recoger y registrar todos los eventos.

4. Análisis de datos

  1. Mirando de lado-dispersión vs transhorizonte área, puerta en "vivas" células basado en tamaño y granularidad y viabilidad marcador tinte.
  2. A continuación, utilizando CD45 brillante violeta 510 y CD31 PerCp Cy5.5, puerta de las células CD45 - CD31 + usando los controles de isotipo y FMO para determinar poblaciones positivas y negativas.
  3. Por último, utilizando CD146 v450 o CD16/32 FITC y PDPN APC, tomar las CD146 - PDPN + y CD16/32-PDPN + células, otra vez usando los controles de isotipo y FMO, para determinar las poblaciones positivas y negativas. Estas células son el LECs.

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Resultados

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Estudios análisis de hígado linfáticos han utilizado principalmente inmunohistoquímica para cuantificar la frecuencia y el diámetro de los vasos linfáticos en el hígado. Sin embargo, este método no permite para la evaluación de LECs en forma de celda por celda o para la expresión de múltiples marcadores de citoquinas, quimioquinas y factores de transcripción. Por lo tanto, preguntamos si hígado LECs puede ser aislados del hígado y evaluado mediante citometría de flujo. Trabajo previo aisl...

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Discusión

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La importancia de LECs en homeostasis inmune y regulación ha llegado recientemente a luz25. Gran parte de la bibliografía linfática se centra en piel y ganglios linfáticos; sin embargo, linfáticos se encuentran en todo el cuerpo26 y, por lo tanto, es necesaria la comprensión de su importancia en diversos órganos. A continuación os mostramos un método en el que se pueden estudiar LECs en el hígado en forma de célula por célula para comprender mejor su expresión concurrente d...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a la GI y programas inmune innata de hígado para el apoyo financiero de este proyecto. B.A.J.T. es también financiado por AI121209 R01.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Clics/medios EHAAIrvine Scientific9195
Colagenasa IVWorthington Biochemical corporationLS004188
DNasa IWorthington Biochemical corporationLS002145Desoxirribonucleasa 1
OptiPrepSigma AldrichD1556Medio de gradiente de densidad
V450 anti ratón CD146 (clon ME-9F1)BD biociencias562232
FITC anti ratón CD146 (clon ME-9F1)Biolegend134706Isotiocianato de fluoresceína (FITC)
Pacific Blue anti ratón CD31(clon 390)Biolegend102422
PerCp/Cy5.5 anti ratón CD31 (clon 390)Biolegend102420Proteínas de peridina-clorofila-cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti ratón PDPN (clon 8.1.1)Biolegend127410Aloficocianina (APC), podoplanina (PDPN)
APC/Cy7 anti ratón CD45 (clon 30-F11)Biolegend103116
Brilliant Violet 510 anti ratón CD45 (clon 30-F11)Biolegend103138
FITC anti ratón CD16/32 (clon 93)Biolegend101306Isotiocianato de fluoresceína (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti ratón CD16/32 (clon 93)Biolegend101324Proteínas de peridinina-clorofila-Cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5)
rojo fantasma 780 colorante de viabilidadTONBO biosceinces3-0865-T100
APC hámster sirio IgG (clon SHG-1)Biolegened402102
PerCp/Cy5.5 rata IgG2a (clon RTK2758)Biolegend400531
FITC rata IgG2 (clon eBR2a)ebioscience1-4321-80
Anti ratón LYVE1 (clon 223322)R& D systemsFAB2125A
anti-ratón Citoqueratina (clon EPR17078)abcamab181598
anti-ratón F4/80 (clon Cl:A3-1)Bio-radMCA497
BSA (fracción V)FischerBP1600-100Albúmina sérica bovina (BSA)
Suero de cabraJackson Immunoresearch017-000-121
Suero de burroJackson Immunoresearch017-000-121
EDTAVWRE177Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) -para tampón de lisis de glóbulos rojos
Cloruro de amonioFischerA687-500para glóbulos rojos Tampón de lisis
Bicarbonato de potasioFischerP184-500para glóbulos rojos Tampón de lisis
Bisturí Feather2975#21
100 μ Filtro de células mFischer22363549
2.4G2en casa/ATCCATCC HB-197Bloque FC para inhibir la unión inespecífica a las células Fc gamma + -hecho de hibridoma
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Corning21-040-CV
Hanks Solución salina equilibrada (HBSS)Gibco14185-052
Suero fetal bovino (FBS)Atlanta biológicosS11550
placa de 96 pocillosCorning3788
placa de 6 pocillosCorning3506
50 mL cónicaTrulineTR2004
15 mL cónicaFalcon352196
1 mL Punta de pipetaUSA scientific1111-2721
200 µ L punta de pipetaUSA scientific1110-1700
10 µ Punta de pipeta LUSA scientific1111-3700
seriológico 10 mL pipetaGreiner Bio-One607107
seriológico 5 mLpipeta Greiner Bio-One606107
Incubadora de célulasFischerHeracell 160i
BD FacsCanto II citómetro de flujoBD biosciences
centrífuga clínicaBeckman rejamodelo X-14R

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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