Artículo de método

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

DOI:

10.3791/58626

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7 de enero de 2019

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1Division of Metabolism, Endocrinology and Lipid Research, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in Saint Louis, 3Department of Ophthalmology and Visual Science, Washington University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Esta técnica describe la grabación en tiempo real del consumo de oxígeno y los tipos de acidificación extracelular en los tejidos retinianos explanted ratón utilizando un analizador de flujo extracelular.

Resumen

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Alta agudeza de la visión es un proceso altamente consumidor de energía, y la retina ha desarrollado varias adaptaciones únicas para precisamente cubrir tales demandas manteniendo la transparencia del eje visual. Las perturbaciones a este delicado equilibrio causan enfermedades cegadoras, tales como la retinopatía diabética. Por lo tanto, la comprensión de los cambios de metabolismo de energía en la retina durante la enfermedad es imprescindible para el desarrollo de tratamientos racionales para diversas causas de pérdida de visión. La reciente llegada de los analizadores de flujo extracelular comercialmente disponible ha realizado el estudio del metabolismo energético retiniana más accesible. Este protocolo describe el uso de tal un analizador para medir las contribuciones al suministro de energía retiniana a través de sus brazos dos principio - fosforilación oxidativa y glucólisis - mediante la cuantificación de cambios en las tasas de consumo de oxígeno (OCR) y extracelular tipos de acidificación (ECAR) como proxies para estas vías. Esta técnica se realiza fácilmente en el tejido retiniano explanted, facilitar la evaluación de las respuestas a múltiples agentes farmacológicos en un solo experimento. Firma metabólica en las retinas de los animales que carecen de señalización de fotorreceptores de varilla se comparan con controles de tipo salvaje con este método. Una limitación importante en esta técnica es la falta de capacidad de discriminar entre la utilización de la energía luz-adaptado y oscuro-adaptado, una consideración fisiológica importante en el tejido retiniano.

Introducción

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La retina es el tejido más demanda de energía en el sistema nervioso central1. Como la mayoría de los tejidos, genera trifosfato de adenosina (ATP) mediante la glucólisis en el citosol o a través de fosforilación oxidativa en las mitocondrias. La ventaja energética de la fosforilación oxidativa en la glucólisis para producir ATP a partir de una molécula de glucosa es clara: 36 moléculas de ATP generan por ex vs 2 moléculas de ATP que se generan a partir de este último. En consecuencia, las neuronas retinianas principalmente dependen de la respiración mitocondrial para suministro de energía y esto se refleja en su alta densidad de mitocondrias2. Sin embargo, la retina también depende en gran medida maquinaria glicolítica incluso cuando el oxígeno es abundante. Este proceso de glucólisis aeróbica fue descrito originalmente en las células cancerosas por Otto Warburg3, quien una vez observó que la retina el tejido sólo poste-mitotic capaces de esta forma de metabolismo4. Desde las observaciones iniciales, se han descrito muchos tejidos poste-mitotic para participar en diversos grados de glucólisis además de fosforilación oxidativa para atender sus demandas de ATP.

Fototransducción, pigmento visual reciclaje, biosíntesis de los segmentos externos del fotorreceptor y actividad sináptica son todos procesos exigentes de energía en los fotorreceptores, la subclase neuronal predominante en la retina. Pero la necesidad de transportar activamente los iones contra su eléctrico y gradientes de concentración es en gran medida el proceso energéticamente más lento en las neuronas1. Fotorreceptores son neuronas peculiar en el sentido que ellos son despolarizados en ausencia de estímulo (es decir, en la oscuridad), mientras que un ligero estímulo provoca cierre de canal y subsecuente hiperpolarización. Por lo tanto, en la oscuridad, la retina consume grandes cantidades de ATP para mantener su despolarización o "corriente oscura" como comúnmente se le llama. Desde un punto de vista adaptativo, un desafío importante en el suministro de estas grandes cantidades de ATP es la necesidad de los organismos mantener la claridad visual a través del eje óptico. La arquitectura retiniana invertida en criaturas modernas es la solución dominante, ya que mantiene la densa red capilar suministro de fotorreceptores lejos el camino de la luz. Pero esta maravilla de la bioingeniería natural coloca a la retina en un precipicio en términos de reserva metabólica. Incluso los pequeños insultos a retina potencialmente pueden perturbar el delicado equilibrio de la oferta de energía a la demanda, y la disfunción visual o ceguera Franco puede sobrevenir rápidamente.

Dadas las demandas energéticas únicas de la retina neural, junto con su restricción apretado de la fuente vascular, una medición precisa del consumo de ATP en la retina y sus cambios durante la enfermedad podría tener profundas implicaciones en la comprensión y el tratamiento de cegamiento de condiciones tales como retinitis pigmentosa y la retinopatía diabética. Tradicionalmente, estas medidas requieren equipo costoso, diseñado con la mayoría de los estudios de un puñado de laboratorios enteramente dedicado a las mediciones de la actividad metabólica2,5,6, 7,8. Las técnicas incluyen ensayos individuales de metabolitos específicos, estudios tracer usando precursores marcados con radio, grabación usando electrodos de Clark y metabolómicos perfiles9el consumo de oxígeno.

Con los avances en la tecnología de alto rendimiento y mayor disponibilidad de dispositivos comerciales, técnicas de registro del metabolismo retiniano son cada vez más accesibles y asequibles. El método descrito aquí mide tanto la fosforilación oxidativa y glicolisis en retina utilizando explantados tejido y un analizador de flujo extracelular comercialmente disponibles9,10,11,12. Este analizador por separado registra tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR), sirviendo como indicadores indirectos de la fosforilación oxidativa y la glicolisis, respectivamente13. Estas mediciones son realizadas por una sonda sumergida dentro de una microcámara en el tejido de interés. Esta adaptación de los métodos previamente publicados utiliza una placa de captura diseñada originalmente para los islotes pancreáticos de Langerhans para grabar la actividad metabólica en secciones pequeñas, circulares de retina de ratón. Múltiples exposiciones farmacológicas pueden entregarse al tejido durante el curso de una sola grabación porque el sistema contiene 4 puertos de inyección para cada muestra bien. Utilizando este sistema con protocolos aparte optimizados para grabaciones de ECAR y OCR, las respuestas de tipo salvaje retinas se pueden comparar con retinas carentes transducina (Gnat1- / -), una causa de ceguera de noche inmóvil congénita en los seres humanos14.

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Protocolo

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Protocolos siguieron la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología declaración para el uso de los animales y fueron aprobados por la Universidad de Washington.

1. animal preparación

  1. Mantener animales en vivienda estándar con una 12 horas oscuras al ciclo de luz de 12 horas. Comenzar los experimentos en estandardizado veces para evitar los efectos, normalmente en la mañana poco después de que las luces se encienden.

2. preparación de la solución

  1. Preparar los medios base disolviendo 8.4 mg de medios en polvo en agua destilada doble H2O (ddH2O) y ajuste el pH a 7.4 con HCl o NaOH, hasta un volumen final de 1 L. filtro esterilizar esta solución con un filtro de 0,22 μm cultivo de tejidos.
    1. Añadir 1 M glucosa y piruvato de sodio 100 mM a los medios para alcanzar las concentraciones finales de 5 mM de glucosa y piruvato de 1 mM.
    2. Lugar una alícuota de 50 mL del medio base en un baño de agua de 37 ° C.
  2. Preparar la solución de lisis, para cuantificación del tejido al final del análisis de flujo, mediante la adición de tris base 10 mM, polietileno glicol éter de tert-Octylpheny al 0,2% (v/v) y EDTA 1 mm, en Dec2O. mezcla hasta que todos los componentes totalmente disuelven y ajustar pH a 8.0.
  3. Para el protocolo de estrés mitocondrial, preparar un balance de 11 μm de oligomycin, un inhibidor de la sintasa de ATP, disuelto en los medios de base a una concentración final de 1 μm en el pozo. Preparar un stock de 11 μm de cianuro de carbonilo - 4-(de trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), un agente Desacoplador, disuelto en los medios de base a una concentración final de 1 μm en el pozo. Preparar un cóctel de inhibidores de la cadena de transporte de electrones, rotenona y antimicina A (RAA) mediante la adición de la rotenona a 11 μm y antimycin A 22 μm, disuelto en los medios de base a una concentración final de rotenona de 1 μm y 2 μm antimycin A en el bien.
  4. Para el protocolo de la glucólisis, preparar un caldo de 220 mM de glucosa disuelto en media base, a una concentración final de 20 mM en el pozo. También preparar un stock de 1.1 M de 2-desoxiglucosa (2-DG), un inhibidor competitivo de la glucosa y antagonista de glucolisis, disolviendo en medio base. Esto apuntará a una concentración final de 100 mM 2-DG en el pozo.

3. calibración del instrumento

  1. Para calibrar la instrumentación para un ensayo de flujo extracelular, añadir 1 mL de solución de calibración a cada pozo del cartucho de sensor (total de 24 pozos) e incube a 37 ° C en un CO2-libre de la incubadora durante la noche (o por lo menos 8 h).
  2. Aditivos para el protocolo de estrés mitocondrial o el protocolo de la glicolisis la carga en cada puerto del inyector, A la D, en el cartucho de sensor, ajuste por cambios en el volumen en el pozo.
    Nota: Por ejemplo, un ensayo típico incluiría 45 μl de aditivo en el primer puerto de inyector, 49.5 μL en la segunda, 54,5 μL en la tercera y 60 μL en la última, suponiendo un volumen bien inicial de 450 μl.
  3. Durante el primer varios experimentos, la carga media base en Puerto A medir cuánto tejido movimiento/artefacto se produce después de una inyección de puerto.
  4. Permiten que la placa de sensor cargado a incubar a 37 ° C en una incubadora sin CO2 de al menos 60 minutos.

4. aislamiento del tejido retiniano dulce ratón

Nota: Este paso es una adaptación de la técnica del Dr. Barry Winkler15.

  1. Después de administrar anestesia profunda utilizando un cóctel estándar de ketamina/xilacina, eutanasia ratones por dislocación cervical.
  2. Use un par de pinzas curvas medianas para sostener el globo posterior en el nervio óptico y suavemente aplique presión hacia delante para proptose el ojo (figura 1A).
    1. Con una cuchilla de afeitar limpia, crean una incisión de limbo a Limbo a través de la córnea usando un pase único y deliberado de la hoja.
    2. Usando bien, pinzas de McPherson de estilo angulares, pellizque el globo posterior para expresar las membranas hialoides anteriores de la incisión corneal y lente. Deseche estos tejidos.
    3. Repetir la maniobra de aplastarlos con el fórceps para expresar la retina neural.
    4. Usando las pinzas como una cuchara para levantar la retina, en lugar de agarrar el tejido, transfiera la retina lejos de la incisión corneal y coloque directamente en la prensa caliente en un plato de 3 cm o una placa de cultivo de tejidos bien 6 cluster.
  3. Usar dos pares de pinzas de McPherson de estilo finos y angulados para disecar suavemente restantes vítreo de la retina. Esto se hace mejor agarrando el vítreo en la periferia de la retina Copa y tirando hacia el centro, con un final disinsertion del cuerpo vítreo del centro en su conjunto. Usando las pinzas, quite cualquier residual epitelio retiniano del pigmento de la superficie de fotorreceptores de la retina.
    1. Corte una punta de pipeta P1000 con una cuchilla de afeitar para crear una abertura ~ 4 mm para evitar trauma indebida en el delicado tejido retiniano durante maniobras de transferencia.
    2. Transferir el tejido retiniano aislado en medios frescos usando una punta de pipeta P1000 corte.
    3. Cortar Punzones de 1 mm de la retina en el nervio óptico con una biopsia de 1 mm golpe equipado con un émbolo para sacar el tejido en el caso de se aloja en el alesaje (figura 1B). Fijar los retinales golpes a un lado en medios limpios conservados en un bloque de 37 ° C o cojín de calefacción.

5. Protocolo

  1. Transferencia de golpes individuales a una microplaca de captura de 24 pocillos islote mediante una corte punta P1000, aspiración 450 μl de medios junto con el tejido.
  2. Bien, utilizar pinzas rectas para manipular suavemente golpes en el centro de la microplaca. Mantener golpes orientados en la misma dirección (por ejemplo, parte de la célula del ganglio hacia arriba).
    1. Resto de la placa de captura de una almohadilla eléctrica o calefacción bloque conjunto a 37 ° C, estos pasos se repiten para las muestras restantes.
      Nota: Para cada experimento, dejar reposar 3-4 pocillos del blanco con 450 μl de base medios sirven como controles negativos. En el restante 20-21 pozos, prueba cada repetición biológica por triplicado. Por lo tanto, permitirá a cada placa de 24 pozos para la grabación de 6-7 animales diferentes o condiciones de tratamiento.
  3. Evitando las burbujas de aire, posición suavemente el islote capturar inserciones de red en cada pocillo con pinzas y fijar los insertos con un émbolo metálico, o con una punta de pipeta P1000 corte (figura 1 C).
    Nota: Evitar el movimiento excesivo del tejido durante este paso para mantener la posición de perforación retiniana en el centro de la microcámara muestra. Burbujas de aire seriamente distorsionan las lecturas de OCR. Aunque la microcámara tiene profundidad suficiente para dar cabida a retina de ratón típico (figura 1), ocasionalmente defectos de mecanizado en los insertos de malla pueden causar tejidos a comprimirse excesivamente durante la inserción de la pantalla. Si esto sucede, simplemente tome nota de los tejidos aplastados y excluir muestra el análisis final.
  4. Incubar la placa de tejido en 37 ° C CO2-incubadora libre de al menos 60 minutos.
  5. Programar el analizador de flujo extracelular mediante mezcla, espera, medida y repita los comandos. Por ejemplo, un experimento típico con el tejido retiniano puede incluir lo siguiente: Mezcle 2 minutos, espere 2 minutos y medir 5 minutos. Repetir el experimento con estos tres pasos entre 5 - 8 veces (ciclos) para una grabación de línea de base y después de la inyección de cada compuesto está probando durante la marcha.
  6. Presione el botón de inicio del programa en el analizador de flujo extracelular y siga las instrucciones en la pantalla para insertar el cartucho de sensor para la calibración.
  7. Al final de la calibración, siga las instrucciones en pantalla para reemplazar la placa calibrant con la placa que contiene las muestras de retinales.
  8. Permita que el programa a ejecutar, conforme a lo programado. Al finalizar la carrera, siga las instrucciones en la pantalla para extraer la placa de tejido. Ver los resultados de la carrera y guarde el archivo de datos.
  9. Con una aguja de calibre 20 doblada y pinzas, remueva todo acoplamiento de los pozos, dejando el golpe retiniano.
  10. Cuidadosamente aspirar los medios de comunicación de los tejidos y lavar el tejido dos veces con 0,5 mL de solución salina fría con tampón fosfato (PBS). Aspire el PBS después de lavarse.
  11. Añadir 100 μl de tampón de lisis para cada bien y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar el tejido.
  12. Cuantificar niveles de entrada basados en total ADN bicatenario (dsDNA) o el contenido de proteína total.
    Nota: A continuación se basa en un ensayo de dsDNA comercialmente disponibles.
  13. Diluir las muestras sometidas a lisis 1:1 mediante la adición de 100 μl de buffer Tris-EDTA (TE) y transferir 100 μl de la muestra diluida a una placa bien 96.
    1. Añadir 100 μl de buffer de detección en cada pozo. Después de mezclar durante 2-5 minutos, cuantificar la fluorescencia después de excitación a 480 nm y emisión a 520 nm, en comparación con una curva estándar.
    2. Normalizar el trazado de flujo extracelular crudo contenido de DNA en el pozo.
      Nota: En los resultados aquí presentados, las muestras se normalizan a 50 ng dsDNA - una cantidad típica en un golpe retiniana de 1 mm. Por lo tanto, valores absolutos presentados aquí podrá compararse con los estudios que presenta datos "por golpe retiniano". Normalizar los trazos a un estándar interno, tales como la línea de base a una concentración de glucosa de 5 mM.

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Resultados

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Utilizando las técnicas descritas (resumidas en la figura 1), explantes de retinales de 8 semanas de edad tipo de salvaje (WT) ratones fueron en comparación con pareados por edad y antecedentes transducina null ratones (Gnat1- / -). Porque Gnat1- / - animales carecen de la maquinaria para cerrar nucleótido cíclico cerrado canales iónicos en respuesta a estímulos de luz, los fotorreceptores de la barra permanece...

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Discusión

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OCR y ECAR se miden fácilmente en el tejido retiniano explanted utilizando un equipo bioanalyzer utilizando las técnicas descritas. Este método parte de los de otros grupos en varios pasos críticos. Los tejidos retinianos son aislados a través de una incisión corneal grande sin enucleando el mundo, originalmente descrito por Winkler15. Este método de aislamiento retiniana permite una transferencia rápida del ojo en la placa de captura de tejido (a menudo dentro de 5 minutos). Los tejidos son mante...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Alexander Kolesnikov y Dr. Vladimir Kefalov para proporcionar Gnat1- / -ratones, información útil y consejos y por leer el manuscrito.

Este trabajo fue financiado por los NIH EY025269 (RR), el centro de investigación de la Diabetes en la Universidad de Washington - NIH DK020579 (JRM y RR), un premio de desarrollo de carrera de la investigación para evitar la ceguera (RR), la Fundación Horncrest (RR), un premio de desarrollo de carrera de JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CSA), DK020579 (CSA), DK056341 (SFC) y DK114233 (JRM).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Analizador de flujo extracelular Seahorse XF24Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (incluye: microplaca de captura de islotes, cartucho de sensor y solución de calibre)Agilent, Santa Clara, CA101174-100Incluye microplaca de captura de islotes, cartucho de sensor y solución de calibrador
Medios RPMI 1640 (medio en polvo)Millipore-SigmaR1383RPMI 1640 Medios con L-Glutamina y sin glucosa ni bicarbonato de sodio
D-GlucosaMillipore-SigmaG82701M D-Glucosa filtrada, para la preparación de medios
Piruvato de sodioCorning25000CI100 mM piruvato de sodio
Antimicina-AMillipore-SigmaA8674Componente del protocolo de estrés mitocondrial
FCCPMillipore-SigmaC2920Componente del protocolo de estrés mitocondrial
RotenonaMillipore-SigmaR8875Componente del protocolo de estrés mitocondrial
2-desoxiglucosaMillipore-SigmaD6134Componente del protocolo de glucólisis Punzones
de biopsia de piel de 1 mm con émboloIntegra-Miltex33-31AA-P/25 Herramienta deexplantación de tejido de retina
Dumont Mini-Forceps StraightFine Science Tools11200-10 Herramienta deexplantación de tejido de retina
Dumont Medical #5/45 Pinzas - Ángulo de 45 gradosHerramientas de ciencia fina11253-25Herramienta de explantación de tejido de retina
Pinzas Dumont #7 - Herramientas de ciencia fina curvas11271-30 Herramienta deexplantación de tejido de retina
Quant-iT Kit de ensayo de dsDNA Picogreen FisherScientificP7589Ensayo
de normalización de cargaTrizma base (Tris base)Millipore-SigmaT6066Componente del tampón de lisis
Triton X-100 (polietilenglicol tert-octilfenil éter)Millipore-SigmaX100Componente del tampón de lisis
0.5M EDTA pH 8.0AmbionAM9262Componente del tampón de lisis
C57BL/6J ratones Laboratorios Jackson  Cepa 000664animales
Gnat1-/- y Gnat1+/+ Dr. Vladímir Kefalov; Facultad de Medicina de la Universidad de WashingtonAnimales

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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