Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena

Resumen

Se describe un sencillo procedimiento litográfico para la inmovilización de las moléculas de ADN del gen-longitud sobre una superficie, que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de expresión génica sin células en biochips.

Resumen

Inmovilización de genes en superficies litográfico estructurados permite el estudio del gen compartimentado procesos de expresión en un sistema de biorreactor de microfluidos abierto. En contraste con otros enfoques hacia sistemas celulares artificiales, tal configuración permite un suministro continuo con gene expresión reactivos y drenaje simultáneo de productos de desecho. Esto facilita la implementación de procesos de expresión génica sin células durante largos períodos de tiempo, lo cual es importante para la realización de sistemas de retroalimentación reguladora de genes dinámico. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la fabricación de biochips genéticos utilizando una técnica litográfica de simple-to-use basada en reacciones de desplazamiento de hebra de ADN, que utiliza exclusivamente los componentes comercialmente disponibles. También proporcionamos un protocolo sobre la integración de genes compartimentadas con un polidimetilsiloxano (PDMS)-sistema de microfluidos. Por otra parte, nos muestran que el sistema es compatible con microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total, que puede ser utilizado para la observación directa de las interacciones moleculares entre el ADN y las moléculas contenidas en la mezcla de la expresión.

Introducción

Libre expresión génica, las reacciones son de gran interés para diversas aplicaciones en Bioquímica, biotecnología y biología sintética. Libre expresión de las proteínas fue instrumental para la preparación de las muestras de proteína pura, que fueron la base para numerosos estudios de biología estructural. Por ejemplo, sistemas libres de células fueron utilizados con éxito para la expresión de la proteína complejos¹ o membrana proteínas², que son difíciles de producir con la expresión de la célula. En particular, libre expresión génica reacciones también fueron utilizadas para dilucidar la estructura del código genético....

Protocolo

Nota: Un calendario para las medidas en las diferentes secciones se da en la información complementaria (sección 1).

1. fabricación de microchips

Nota: como substratos obleas de silicio de uso (100 mm de diámetro, 0,525 mm de espesor) con una capa gruesa de 50 nm de dióxido de silicio o vidrio portaobjetos (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 mm x 50 mm, no. 4). Dependiendo de la aplicación, otros tamaños y espesores pueden ser más convenientes.

1. Limpieza de los sustratos a través de un RCA Limpie procedimiento (agua, solución de amoníaco NH₃(aq) 30% y el peróxido de hidrógeno H₂O

Resultados

Litografía de dos etapas: la figura 5 muestra el resultado de un proceso de dos pasos litográficos en un portaobjetos de vidrio con la superposición de patrones de fluorescencia etiquetada DIS hilos.

Expresión de una proteína fluorescente de un cepillo de gene: figura 6 demuestra la expresión de la proteína fluorescente YPet de DNA inmovilizado. En varios puntos de tiem.......

Discusión

Bephore litografía es una técnica robusta y versátil para el modelado inmovilización de ADN o ARN. Sin embargo, el procedimiento incluye varios pasos, que - si - pueden ser una fuente de fracaso o menor rendimiento del sistema.

Un paso crucial en la fabricación de chips de Bephore es la pegilación del sustrato, que proporciona la biocompatibilidad de la superficie. Aquí, el paso de limpieza con un procedimiento RCA es importante, ya que también activa la superficie para la silanización posteri.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Oblea de silicio con dióxido de silicio de 50 nm (sustrato Bephore)Espesor de	la oblea		(µ m): 525 y más; 25, diámetro (mm): 100
oblea de silicio (para molde maestro PDMS)	de la oblea		(µ m): 525 y más; 25, Diámetro (mm): 76.2 (3")
Portaobjetos de vidrio n.º 4	Menzel		22 mm x 50 mm
Portaobjetos de vidrio n.º 1.5	Auxiliar		24 mm x 24 mm
Biotina-PEG-Silano	Laysan Bio		MW 5.000
Tolueno anhidro	Sigma Aldrich (Merck)	244511
Estreptavidina	Thermo-Fisher Scientific	S888
ADN	Tecnologías de ADN integradas ( IDT)
Phusion Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad con tampón HF New	England Biolabs	M0531S	Kit de PCR
Wizard SV Gel y sistema de limpieza de PCR	Promega	A9281	Kit de limpieza de PCR con columna de centrifugación
PURExpress	New England Biolabs	E6800S	Sistema de expresión libre de células
PDMS	Dow Corning	Slygard 184
FluoSpheres	Thermo-Fisher Scientific	F8771
Tubo de PTFE (ID: 0,8 mm, OD: 1,6 mm)	Bola	S 1810-10
EpoCore 20	tecnología micro resist		Photoresist
mr-Dev 600	micro resist technology		Revelador fotorresistente
Ti-Prime	MicroChemicals		Promotor de adherencia
Pegamento de silicona de dos componentes	Picodent	Twinsil
Lámina amarilla con protección UV	Lithoprotect (via MicroChemicals)	Y520E212
Equipment
Mascarillas para fotolitografía	Zitzmann GmbH		64.000 dpi, 180x240 mm
Microscopio vertical	Olympus	BX51	Fotolitografía e imágenes de fluorescencia
Objetivo de inmersión en agua 60x	Olympus	LumPlanFl	Utilizado con Olympus BX51, NA 0.9
Objetivo de inmersión en agua 20x	Olympus	LumPlanFl	Utilizado con cámaras Olympus BX51, NA 0.5
	Fotometría	Coolsnap HQ	Utilizado con Olympus BX51
Fuente de luz	EXFO	X-Cite 120Q	Utilizado con Olympus BX51
Microscopio invertido	Nikon	Ti2-E	Fluorescencia Imagen de la expresión génica
Objetivo 4x	Nikon	CFI P-Apo 4x Lambda	Se utiliza con la cámara Nikon Ti2-E
	Andor	Neo5.5	Se utiliza con Nikon Ti2-E
Fuente de luz	Lumencor	SOLA SM II	Se utiliza con la incubadora de jaula Nikon Ti2-E
	Okolab bold	line	Se utiliza con el controlador de presión Nikon Ti2-E
Elveflow		OB1 MK3
Nanofotómetro	Implen	Medición de la concentración
Limpiador de plasma	Diener	Femto	200 W, operado a 0,8 mbar con la muestra en una jaula de Faraday