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Artículo de método

Detección del flujo Cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la Apoptosis

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DOI:

10.3791/58642

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26 de enero de 2019

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1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar células de cáncer de mama apoptóticas clasificación celular activado por fluorescencia y más detectar la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama cáncer células madre células después de la revocación de la apoptosis por citometría de flujo.

Resumen

La recurrencia del cáncer durante mucho tiempo ha sido estudiada por oncólogos mientras que los mecanismos subyacentes siguen siendo confusos. Recientemente, nosotros y otros encontraron que un fenómeno llamado inversión de apoptosis conduce a mayor colonización en varios modelos de celular bajo diferentes estímulos. Estudios previos se han centrado en el seguimiento de este proceso in vitro e in vivo; sin embargo, el aislamiento de células real invertidas tiene todavía ser alcanzado, que limita nuestro entendimiento sobre las consecuencias de la revocación de la apoptosis. Aquí, aprovechamos un tinte verde detección de caspasa-3/7 a las células de etiqueta con caspasas activadas después de la inducción de apoptosis. Células con señales positivas se clasifican más lejos hacia fuera por celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación para la recuperación. Examen bajo microscopia confocal ayuda a confirmar el estado de apoptosis antes de FACS. Un aumento en la colonización se puede atribuir a menudo a la elevación en el porcentaje de células madre de cáncer (CSC)-como las células. Además, dada la heterogeneidad del cáncer de mama, identificando el origen de estas células de CSC-como sería fundamental para el tratamiento del cáncer. Así, preparamos las células de cáncer no madre mama antes de accionar apoptosis, aislar células caspasa activa y realizar el procedimiento de revocación de la apoptosis. Análisis de citometría de flujo revela que mama CSC-como las células vuelve a aparecerán en el grupo inverso, indicando mama CSC-como las células se transitó de las células de cáncer no madre mama durante apoptosis revocación. En Resumen, este protocolo incluye el aislamiento de apoptotic células de cáncer de mama y la detección de cambios en porcentaje de CSC en células invertidas por citometría de flujo.

Introducción

Cáncer ha sido la principal causa de muerte, haciendo que la pesada carga a los países a nivel mundial1. El cáncer de mama es alta tanto en términos de incidencia y mortalidad en pacientes femeninos entre todos los tipos de cáncer1. Debido a la heterogeneidad del cáncer, una combinación de fármacos se utiliza generalmente en la quimioterapia para lograr cáncer célula muerte2,3,4. Sin embargo, puesto que los medicamentos quimioterapéuticos comunes a menudo destino ADN5,6, proteína síntesis7,8 o microtúbulos dinámica9, las células de rápido crecimiento son afectados la mayoría mientras que células quiescentes como cáncer células madre (CSC) s son generalmente menos afectados10. CSCs son, por lo tanto, más posibilidades de sobrevivir después del tratamiento, que más adelante conduce a resistencia a los medicamentos y el cáncer recidiva10,11. Por lo tanto, eliminación del CSC se ha convertido en un tema importante para el tratamiento del cáncer y estudio del origen de las CMC es necesario.

Se han realizado más estudios sobre el fenómeno de la reversión de la apoptosis en la última década12,13,14,15,16,17,18 , 19. antes de la aparición de este concepto, ha sido ampliamente aceptado que las células irreversiblemente sufrirá apoptosis después de la activación de caspasas. Caspasas son una familia de enzimas de proteína que desempeñan papeles claves en las etapas de iniciación y ejecución de la apoptosis, incluyendo la formación de la apoptosis complejas y la división de downstream sustratos20. Activación de las caspasas verdugo como caspasa 7 caspasa 3 ha sido considerada como el "punto de no retorno" para apoptosis21. Sin embargo, los investigadores observaron recientemente que apoptosis revocación ocurre in vitro y en vivo, en que las células pueden recuperar de apoptosis incluso después de la activación de caspasa12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. por otra parte, de características agresivas tales como mayor resistencia a la original inductor de apoptosis y mayor invasividad se detectan en el cáncer invertido células15. Por lo tanto, se propuso que el porcentaje de CSC-como las células sería mayor en la población invertida en comparación con las células sin tratar, eventualmente contribuir a las características más malas después de apoptosis revocación18.

Anteriormente, muchos esfuerzos se hicieron un seguimiento de la inversión de apoptosis in vitro y lo más importante, en vivo, que de gran ayuda para confirmar la universalidad de este proceso16,17,19. Sin embargo, carece de un estudio sistémico sobre las consecuencias de las células invertidas debido al aislamiento insuficiente de las células que han sufrido realmente apoptosis revocación. Hay que adquirir las células apoptotic puro y recuperarlos para un estudio más profundo. Por lo tanto, utilizamos el marcador bien aceptado tradicionalmente de la activación de caspasas verdugo como el marcador del "punto de no retorno"21 para apoptosis y utilizar celular activado por fluorescencia (FACS) para discriminar caspase-activado Células teñidas de clasificación con colorante verde detección de caspasa-3/7. El tinte es covalente a una secuencia corta de aminoácidos, DEVD, que puede ser reconocido y hendida por activa caspasas 3/7. El escote ayuda a liberar el tinte, que se translocan desde el citosol al núcleo donde se une al ADN y emite fluorescencia fuerte. Este procedimiento evita el uso de una población de células a granel en la que algunas células pueden no han experimentado apoptosis.

CSC o células iniciadoras del tumor se han identificado en muchos tumores sólidos con una sola o una combinación de varios marcador superficial y muy pocos números de estas células son suficientes para los tumores en ratones inmunodeficientes,22,23, forma 24,25,26,27. Una combinación de CD44 y CD24 se ha utilizado comúnmente en estudios de mama CSC y CD44+/CD24– las células han sido definidas como la mama CSC26,27,28,29 , 30. recientemente, hemos realizado una serie de experimentos para confirmar la relación propuesta entre la revocación de la apoptosis y las CMC y demostrar que las células de cáncer de mama invertida ganaron mayor capacidad de formación de tumor in vitro e in vivo con un elevado porcentaje de células con marcadores de CSC18. Aunque no podríamos excluir la posibilidad de que mama CSCs sobreviven mejores y así conseguirán enriquecidos después de la revocación de la apoptosis, cuando aislamos las células cancerosas no madre y sujeto a revocación del apoptosis, CSC surgirá en el originalmente no-vástago de población de células de cáncer, lo que sugiere que no tallo cáncer de las células pueden contribuir al aumento en el porcentaje de CSC durante apoptosis revocación.

Este artículo pretende demostrar la transición de las células de cáncer no madre mama a Mama CSC-como las células después de la revocación de la apoptosis y detectar esta transición mediante citometría de flujo. Las células de vástago no cáncer de mama se preparan inicialmente aislando CD44–/CD24+ de mama las células cancerosas por FACS. Entonces, apoptosis es inducida y confirmado por cambios morfológicos bajo el microscopio. Luego, las células apoptotic positivamente marcado por el tinte verde detección de caspasas 3/7 son aisladas por FACS y más cultivadas en ausencia de inductores de apoptosis apoptosis inversión. Las células invertidas luego se tiñen con marcadores de CSC después de 7 días de recuperación para el análisis cytometric del flujo. Células con CD44+/CD24– marcadores vuelve a aparecerán en la población invertida, sugiriendo que la transición de las células cancerosas no madre a CSC-como las células ha sufrido durante apoptosis revocación.

Revocación de apoptosis se ha observado en el cáncer de varias líneas celulares como las células normales de primaria tratados con estímulos apoptóticos diferentes en vitro12,13. Este proceso también ha sido trazado en Drosophila en vivo16,17,19del modelo. Toda la información sobre el mecanismo subyacente de la recaída del cáncer en modelos de enfermedad de cáncer diferentes y el origen de las CMC puede obtenerse mediante el uso de la técnica como se describe en este manuscrito.

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Protocolo

1. preparación de mama las células cancerosas no madre

  1. Cultura MCF-7 y MDA-MB-231 células en 10 mL de rojo de fenol libre Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) en un plato de 100 mm. Cultura T47D en 10 mL de rojo de fenol libre RPMI 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, 10% inactivado con calor FBS y 1% v/v penicilina-estreptomicina (PS) en un plato de 100 mm. Células en cultivo a 37 ° C en un incubador 95% aire célula cultura de 5% CO2.
    Nota: Rojo de fenol afecta la detección basada en fluorescencia pero también tiene una influencia potencial sobre el crecimiento de las células de cáncer de mama debido a sus efectos similares al estrógeno31. Por ejemplo, rojo de fenol puede estimular el receptor de la progesterona y el crecimiento de las células de MCF-731. También podría estimular el crecimiento de las células de T47D31.
  2. Células de lavado con 2 mL de fosfato tampón salino (PBS) dos veces. Añadir 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA MCF-7 y MDA-MB-231 o 2 mL de 0.25% tripsina-EDTA a las células T47D.
    Nota: La concentración de tripsina-EDTA necesaria para la separación de las células entre tipos de células de cáncer de mama diferentes varían mientras que una concentración inadecuada puede afectar el patrón de expresión de algunos marcadores de superficie celular como CD44 y CD2432.
  3. La cultura los platos por 5 min a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire. Comprobar con frecuencia el desprendimiento de las células bajo el microscopio para evitar que las células del exceso de digestión con tripsina-EDTA.
  4. Cuando más del 90% células separarla, añadir 5 mL de Medio RPMI completo en el plato y pipeta sobre la superficie de la capa de celular varias veces.
  5. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
    Nota: Generalmente, alrededor de 6 x 106 células pueden obtenerse de un plato de 100 mm, cuando la confluencia alcanza el 70%.
  6. Deseche el sobrenadante y resuspender las pelotillas en 106 células/100 μL de tampón FACS (PBS con 0,5% BSA y 0.1% de azida sódica) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  7. Las células se dividen en varios tubos. Para las células MCF-7, se dividen las células en 4 tubos: isotipo dos controles, uno para CD24 solo manchas como control positivo CD24 y uno para la doble tinción.
  8. Para las células T47D, dividir las células en 3 tubos: dos controles de isotipo y uno para la doble tinción.
  9. Para las células MDA-MB-231, dividir las células en 4 tubos: isotipo dos controles, uno para CD44 solo manchas como control positivo de CD44 y uno para la doble tinción.
  10. Centrifugar los tubos a 300 x g y 4 ° C por 5 min deseche el sobrenadante y luego añadir bloque Fc diluido 1:50 en tampón FACS.
  11. Incubar las muestras en hielo por 20 min en la oscuridad antes de la centrifugación a 300 x g y 4 ° C por 5 min descarte el sobrenadante.
  12. Añadir conjugado con fluorocromo anticuerpos monoclonal contra CD44 humano (PerCP-Cy5.5) y CD24 (PE) en diluciones de 1:40 y 1:10 (en tampón FACS) en la doble tinción grupos. Para los controles positivos, añadir CD44 (PerCP-Cy5.5) a MDA-MB-231 y CD24 (PE) las células MCF-7 en la misma concentración, respectivamente.
    Nota: La combinación de CD44 y C24 se ha utilizado comúnmente en el pecho CSC estudio26,27,28,29,30.
  13. Para los grupos de control de isotipo, añadir PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ en un 1:40 dilución como control de isotipo de anticuerpos de CD44 y PE IgG2a de ratón, κ en un 1:10 dilución como control de isotipo de anticuerpos CD24 en 106 células/100 μL.
    Nota: Isotipo de anticuerpos de interés se recomienda utilizar como controles negativos33.
  14. Incubar las muestras (de pasos 1.12 y 1.13) a 4 ° C en la oscuridad durante 30 minutos centrifugar a 300 x g y 4 ° C por 5 min descarte el sobrenadante.
  15. Lavar el pellet dos veces con 500 μL de PBS y centrifugar a 300 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
  16. Resuspender el precipitado en 0,5 mL de PBS y el filtro a través de una malla de nylon de 40 μm antes de ejecutar en un clasificador de células activado por fluorescencia.
  17. Fines de control y compensación, mancha las células MCF-7 con los anticuerpos anti-CD24 conjugado con PE y mancha las células MDA-MB-231 con anticuerpos anti-CD44 conjugado con PerCP-Cy5.5 como controles positivos. Uso de células teñidas con isotipo controles como controles negativos (figura 1).
  18. Recoger las células con CD44–/CD24+ marcadores en tubos fondo redondo poliestireno 12 x 75 mm con 1 mL de medio de colección (sin rojo de fenol RPMI 1640 suplementado con 20% inactivado con calor FBS y 2% v/v PS). Centrifugar los tubos a 300 x g y RT por 5 min y descarte el sobrenadante.
    Nota: CSC-como las células en células de cáncer de mama se definición como CD44+/CD24– células26,27,28,29,30y no tallo las células de cáncer de mama se definen como CD44–/CD24+ células18 (figura 1).
  19. Las células de vástago no cáncer de mama ordenados en la placa de cultivo que contiene medio de colección fresca para seguir cultivándolos a 37 ° C en incubadora cultura 5% CO2 célula de la placa.

2. apoptosis inducción y detección

  1. Preparar 1 mM estaurosporina12,34 en DMSO. Para el grupo tratado de MCF-7, añadir 25 μL de estaurosporina de 1 mM al medio terminado de células MCF-7 hacer hasta 10 mL de volumen final (2,5 μM staurosporina) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.
  2. Retire el medio de cultivo de las células, las células con 2 mL de PBS la colada una vez. Luego añadir 10 mL de medio con 2,5 μM estaurosporina células MCF-7 de 6 h inducir apoptosis, cuando la densidad celular llega a confluencia de 70%.
  3. Preparar 1 mM paclitaxel35,36 en DMSO. Para el grupo tratado de T47D, añadir 12,5 μL de paclitaxel de 1 mM al medio terminado de T47D células que conforman a un volumen final de 10 mL (5 μM paclitaxel) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.
  4. Retire el medio de cultivo de las células y lavar una vez las células con 2 mL de PBS. Luego añadir 10 mL de medio con 5 μM paclitaxel a las células de T47D para 10 h inducir apoptosis, cuando la densidad celular llega a confluencia de 70%.
    Nota: El tiempo de inducción y la concentración de los inductores que inducen la apoptosis deben optimizarse cada vez que una nueva línea celular se utiliza por primera vez.
  5. Para el grupo de MCF-7 Tratado de solvente, añadir 25 μL de dimetilsulfóxido estéril (DMSO) al medio completo de las células MCF-7 para hacer hasta un volumen final de 10 mL (es decir, 0.25% v/v DMSO) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.
  6. Retire el medio de cultivo de las células de MCF-7 tratadas solvente, lavar una vez con 2 mL de PBS. Luego añadir 10 mL de medio con 0.25% v/v DMSO durante 6 h como el control de solvente para STS.
  7. Para el grupo de T47D tratados con solvente, añadir 5 μL de DMSO estéril al medio terminado de T47D células que conforman a volumen final de 10 mL (es decir, 0.05% v/v DMSO) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.
  8. Retire el medio de cultivo de las células tratadas solvente de T47D, lavar una vez con 2 mL de PBS. Luego, añada los 10 mL de medio con 0.05% v/v DMSO para 10 h como el control de solvente para paclitaxel.
  9. Observar los cambios morfológicos de las células tratadas, teñir células con 50 nM Mitotracker Red CMXRos y 250 ng/mL Hoechst 33342 e incubar durante otros 20 minutos a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire. Observar la morfología de la célula apoptótica típicas bajo un 60 x láser confocal de barrido microscopio (figura 2).
    Nota: Morfología de la apoptosis típico incluye blebbing de membrana, contracción celular y condensación nuclear, fragmentación de las mitocondrias con la membrana celular intacta12,13,14,15 ,18,37.

3. aislamiento de células apoptóticas y procedimiento de revocación de Apoptosis

  1. Mancha tanto la apoptosis inductor solventes tratados y MCF-7 o T47D celdas con tinte verde detección de caspasa-3/7 de 3 μM en la concentración celular de 106/ml en la oscuridad durante 30 min a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire.
  2. Filtro de las células a través de una malla de nylon de 40 μm antes de ejecutar en el clasificador para ordenar.
  3. Para fines de sincronización, primero la población principal (R1) de la puerta y excluir los desechos trazando el gráfico de puntos con dispersión hacia delante y dispersión lateral (figura 3).
  4. Utilice las células no tratadas sin añadir el colorante verde de caspasa-3/7 detección como un control negativo para la región negativa (R2) de la puerta (Figura 3A).
  5. Utilice las células tratadas con staurosporina12,18,34 por 24 h y teñidas con el tinte como control positivo para la región positiva (R3) la puerta (figura 3B).
  6. Recoger las células positivas (R3) de los grupos tratados con inductor de tubos fondo redondo poliestireno 12 x 75 mm con 1 mL de medio de colección (igual que el medio de colección en paso 1.18) (figuras 3C-3D). Centrifugar los tubos a 300 x g y RT por 5 min y descarte el sobrenadante.
  7. Recoger las células negativas (R2) de los grupos tratados con solvente en tubos de poliestireno fondo redondo 12 × 75 mm con 1 mL de medio de colección como en el paso 3.6 (figuras 3E-3F).
    Nota: Una pequeña porción de células (como las 10.000 células) puede ser recopilada y vuelva a ejecutar en el clasificador para verificar el patrón del marcador activa caspasas. Si sobre el 90% de células tratadas con solvente ordenadas se muestran en la región de caspasa-negativo o más 90% de células tratadas con inductor seleccionadas se muestran en la región de caspasa-positivo, estas células colectadas se creen para ser relativamente puro (figuras 3C-3F). De lo contrario, debe restablecerse la región clasificación o clasificador.
  8. Resuspender las células ordenadas en medio de la colección fresca y semilla les en placas de cultivo de tejidos de 12 pozos y cultivo a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire durante 7 días para la reversión de la apoptosis.

4. confirmación de la Apoptosis en caspasa activa las células

  1. Mezcla 10 mM HEPES, 140 mM NaCl y CaCl2 de 2,5 mM para preparar el enlace de anexina tampón (pH 7.4). Almacenar el buffer a 4 ° C y evitar el buffer para exponer a la luz.
  2. Prepare una solución de trabajo de 100 μg/mL de yoduro de propidio (PI) por dilución 5 μl de 1 mg/mL solución en 45 μl de tampón de annexin-enlace PI. La solución a 4 ° C y evitar que la solución para exponer a la luz.
    Nota: PI es un mutágeno potencial y debe ser manejado con cuidado.
  3. Preparar las células tratadas con inductor como en los pasos 2.1 y 2.5.
  4. Recoger el tratamiento inductor de la MCF-7 o T47D células mediante pipeteo el medio sobre la capa de células de 3-5 veces para separar las células. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL.
  5. Centrifugar a 300 x g y RT por 5 min, descartar el sobrenadante.
  6. Resuspender las células con medio completo en la concentración celular de 106/ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y mancha las células 3 μM caspasas 3/7 detección de verde medio de contraste en la oscuridad durante 30 min a 37 ° C.
  7. Centrifugar a 300 x g y RT para 5 min descartar los sobrenadantes.
  8. Lavar las células con 1 mL de PBS y centrifugar a 300 x g de helado y 4 ° C por 5 min descartar los sobrenadantes.
  9. Resuspender las células en 100 μL de tampón de Unión anexina con el añadir 5 μL del conjugado anexina V y 1 μl de 100 μg/mL PI trabajo solución cada 100 μL de suspensión celular e incubar las células durante 15 min a temperatura ambiente.
    Nota: Anexina V y PI se utilizan juntos para etiquetar las células apoptotic en el flujo cytometry38,39,40.
  10. Añadir 400 μL de tampón de Unión anexina, mezcla suavemente. Mantener las muestras en hielo antes de ejecutar en un citómetro de flujo.

5. medición de mama CSC-como las células mediante citometría de flujo

  1. Cosecha el MCF-7 invertida en ambos grupos tratados con inductor o solvente con 0.05% tripsina-EDTA. Cosecha de células T47D en ambos grupos tratados con inductor o solvente o con 0.25% tripsina-EDTA como en los pasos 1.2 a 1.5.
  2. Teñir las células con los anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD44 humano (PerCP-Cy5.5) y CD24 (PE) como en el paso 1.12. Mientras tanto, preparar los controles de isotipo en los pasos 1.13.
  3. Las células en un citómetro de flujo y detectar el porcentaje de células con CD44+/CD24– marcadores.

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Resultados

Para observar la transición del pecho no tallo las células cancerosas de mama CSC-como las células, una primera clasificación de CD44–/CD24+ se necesitan las células de cáncer de mama. Para la línea de células MCF-7, que alrededor del 0.15% células con marcadores de CSC en la población original (figura 1), este paso contribuyó a excluir la posibilidad de enriquecimiento del CSC durante apoptosis revocación. Por el contrario, si hay no ha...

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Discusión

Este protocolo describe una manera directa y clara para la detección de la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama CSC-como las células como resultado de la revocación de la apoptosis. Confirmación de las propiedades de la CSC de estas células invertidas podría ser asistido usando n vitro mammosphere formación ensayo y en vivo xenograft trasplante en ratones inmunodeficientes18,24,26 ,<...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la innovadora tecnología fondo de innovación tecnología de la Comisión: financiamiento de apoyo desde el estado clave de laboratorio de Agrobiotecnología (CUHK), el fondo de investigación biomédica de Lo Kwee-Seong y Lee Hysan Fundación. YX fue apoyado por la beca de postgrado de la CUHK.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MCF-7 Colección deCultivos Tipo Americanos (ATCC)HTB-22
MDA-MB-231Colección de Cultivos Tipo Americanos (ATCC)HTB-26
T47DColección de Cultivos Tipo Americanos (ATCC)HTB-133
Reactivo
0.05% tripsina-EDTAInvitrogen25300054
0,25% tripsina-EDTAInvitrogen25200072
Alexa Fluor 680 anexina V conjugadaInvitrogenA35109
albúmina sérica bovinaUSB9048-46-8
CaCl2 · 2H2OSigma-AldrichC-5080
CellEvent caspasa-3/7 colorante fluorescente verdeInvitrogenC10423
dimetilsulfóxidoSigma-AldrichD2650
Fc blockMiltenyi Biotec130-059-901
suero fetal bovinoInvitrogen16000044inactivado por calor
USB16926
Hoechst 33342InvitrogenH3570
L-glutaminaInvitrogen25030081
Mitotracker Red CMXRosInvitrogenM7512
anticuerpos monoclonales contra CD24humano BD Biosciences555428PE Clone:ML5
Lote:5049759
RRID:AB_395822
monoclonales contra CD44humano BD Biosciences560531PERCP-CY5.5 Clon:G44-26
Lote:7230770
RRID:AB_1727485
NaClSigma-Aldrich31434
paclitaxelSigma-AldrichT7402
PE Ratón IgG2a, κ Control de isotipoBD Biosciences554648clon:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicilina-estreptomicinainvitrogen15070-063
PerCP-Cy5.5 Ratón IgG2b, κ Control de isotiposBD Biosciences558304Clon: 27-35
RRID:AB_647257
salina tamponada con fosfatoThermo Fisher Scientific21600010
yoduro de propidioInvitrogenP1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medioInvitrogen11835055
fénol azida sódicaSigma-AldrichS2002
estaurosporinaSigma-AldrichS4400
Equipment
100 mmplato de cultivo Greiner Bio-One664160
de cultivo de tejidos de 12 pocillosThermo Fisher Scientific150628
Cell Strainer 40 μ m malla de nylonBD Biosciences08-771-1
Paquete de software FACSuite v1.0BD Biosciences651360
FACSVerseBD Biosciences651155
Microscopio confocal FluoView FV1000 OlympusIX8160X objetivo
FV10-ASW Software de visualización Ver.4.2bOlympus-poliestireno
de fondo redondo 12 y tiempos; Tubos de 75 mmBD Biosciences352003
Clasificador S3eBio-Rad1451006
HEPES anticuerpos solución sin rojo placas

Referencias

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