Este protocolo describe un flujo de trabajo detallado para la generación y ex vivo de caracterización de virus oncolíticos para expresión de inmunomoduladores, usando virus de sarampión codificación tienen células T actores como ejemplo. Aplicación y adaptación a otras plataformas de vector y los transgenes acelerarán el desarrollo de nuevos immunovirotherapeutics para la traducción clínica.
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Artículo de método
Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Inmunoterapia de cáncer exitoso tiene el potencial para lograr un control tumoral a largo plazo. A pesar de los éxitos clínicos recientes, sigue siendo una necesidad urgente de terapias seguras y eficaces, adaptadas a perfiles inmune individuales del tumor. Virus oncolíticos permiten la inducción de la respuesta inmune antitumoral así como expresión génica restringidos por el tumor. Este protocolo describe la generación y ex vivo análisis de vectores oncolíticos de inmunomoduladores. Centrándose en el virus de la vacuna de sarampión codificación tienen actores de células T como ejemplo, la metodología general se puede adaptar a otras especies de virus y los transgenes. El actual flujo de trabajo incluye el diseño, reproducción, rescate y propagación de virus recombinantes. Ensayos para analizar la cinética de replicación y la actividad lítica del vector, así como funcionalidad de la aislada inmunomodulador ex vivo se incluyen, facilitando la generación de nuevos agentes para el desarrollo adicional en modelos preclínicos y en última instancia traducción clínica.
Introducción
Virus oncolíticos (OVs) se están desarrollando como terapéutica contra el cáncer que específicamente replicar dentro y matar a las células del tumor dejando intactos los tejidos sanos. Ahora se ha vuelto común comprensión que viroterapia oncolíticos (OVT), en la mayoría de los casos, no depender sólo de lisis completa del tumor por la eficiente replicación y propagación del virus, pero requiere de mecanismos adicionales de acción para el éxito del tratamiento, incluyendo vascular y estromal orientación y estimulación inmune1,2,3,4. Mientras ....
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Protocolo
Nota: [O], [P] y [M] indican subdivisiones aplicables a: OVs en general, paramyxoviruses (la mayoría) o MV, respectivamente. [B] indica secciones específicas para los transgenes BTE.
1 clonación de Transgenes codificación inmunomodulador en vectores de Virus de sarampión
-
[O] diseño insertar secuencia.
- [O] decidir inmunomodulador de interés basados en la investigación de la literatura o en datos exploratorios como pantallas genéticas41 y derivar la secuencia de cDNA correspondientes adecuadas bases de datos como GenBank, el archivo europeo del nucleótido, o la sis....
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Resultados
La figura 1 ilustra el mecanismo de acción de los virus de sarampión oncolíticos tienen células T actores de codificación. Un diagrama de flujo que representa el flujo de trabajo de este protocolo se presenta en la figura 2. La figura 3 muestra un ejemplo de un genoma del virus del sarampión modificado oncolíticos. Esto proporciona una representación visual de los cambios específico.......
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Discusión
Oncolíticos inmunoterapia (es decir., OVT en combinación con inmunomodulación) es muy prometedor para el tratamiento del cáncer, exigiendo más desarrollo y optimización de virus oncolíticos que codifican las proteínas inmunomoduladoras. Este protocolo describe métodos para generar y validar tales vectores de pruebas posteriores en modelos preclínicos relevantes y potenciales futuros traducción clínica en nuevas terapias contra el cáncer.
Numerosas plataformas de virus oncolíticos dife.......
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Divulgaciones
Engeland C.E. se cotizan como co-inventor de una patente con respecto a los virus ARN Immunovirotherapy de cáncer de la Universidad de Heidelberg. J.P.W. Heidbuechel no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
Estos métodos fueron establecidos en el grupo de Viroterapia dirigido por el Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts en el centro nacional para enfermedades tumorales en Heidelberg. Estamos agradecidos a él y a todos los miembros del equipo de laboratorio, especialmente el Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler y Jessica Albert. Este trabajo fue apoyado por el Else Kröner-Fresenius-Stiftung (beca 2015_A78 a Engeland C.E.) y la Fundación de ciencia nacional alemana (DFG, conceder EN 1119/2-1 a Engeland C.E.). J.P.W. Heidbuechel recibe un estipendio por la escuela de posgrado Helmholtz para la investigación del cánc....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Rapid DNA Dephos & Kit de ligadura | Roche Life Science, Mannheim, Alemania | 4898117001 | |
| CloneJET Kit de clonación de PCR | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania | A9539-500G | |
| QIAquick Kit de extracción de gel | QIAGEN, Hilden, Alemania | 28704 | |
| NEB 10-beta Competente E. coli | New England Biolabs (NEB), Fráncfort del Meno, Alemania | C3019I | |
| LB medio después de Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | X964.1 | |
| Ampicilina | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | HP62.1 | |
| QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Alemania | 27104 | |
| Enzima de restricción HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Fráncfort del Meno, Alemania | R3104S | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Alemania | 31966-021 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Biosera, Boussens, Francia | FB-1280/500 | |
| FugeneHD | Promega, Mannheim, Alemania | E2311 | puede ser reemplazado por el reactivo de transfección de elección |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania | K0129 | |
| Celdas Vero | ATCC, Manassas, VA, EE. UU. | CCL81 | |
| B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | disponibles bajo pedido | |
| Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Alemania | ACC 342 | |
| Opti-MEM (medio sin suero) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 31985070 | |
| Célula colorimétrica Kit de viabilidad III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Alemania | PK-CA20-300-1000 | incluye reactivo XTT |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de DulbeccoGibco | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 14190-094 | |
| Columnas de centrifugado QIAquick Ni-NTA | QIAGEN, Hilden, Alemania | 31014 | |
| Cloruro de sodio | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | 3957.3 | |
| Imidazol | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Alemania | UFC901024 | |
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Merck Milipore | 71285-3 | |
| IgG de suero humano | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania | I4506 | |
| Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-092-257 | RRID: |
| AB_871939 IgG1 de ratón, control de isotipo kappa, ficoeritrina conjugada, clon MOPC-21 anticuerpo | BD Biosciences, Heidelberg, Alemania | 555749 | RRID: AB_396091 |
| Anticuerpo anti-HA-biotina, clon 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania | 12158167001 | RRID: |
| AB_390915 Microperlas anti-biotina | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-090-485 | |
| Columnas MS | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-042-201 | |
| Separador MiniMACS | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-042-303 | |
| Tampón RIPA | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, EE. UU | MB-030-0050 | |
| CytoTox 96 Ensayo de citotoxicidad no radiactiva | Promega, Mannheim, Alemania | G1780 | Incluye solución de lisis 10x, solución de sustrato (mezcla de sustrato y tampón de ensayo) y solución de parada |
| Elevador de celdas | Corning, Reynosa, México | 3008 | |
| Platos de 10 cm | Corning, Oneonta, NY, EE. UU | . 430167 | |
| platos de 15 cm | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania | 639160 | |
| Placas de 96 pocillos, TPP con fondo en U | , Trasadingen, Suiza | 92097 | |
| Placas de 96 pocillos, fondo plano | Neolab, Heidelberg, Alemania | 353072 | |
| placas de 6 pocillos | Neolab, Heidelberg, Alemania | 353046 | |
| placas de 12 pocillos | Neolab, Heidelberg, Alemania | 353043 | |
| tubos de 50 ml nerbe | plus, Winsen/Luhe, Alemania | 02-572-3001 | |
| Matraces de cultivo celular T175 | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
| 0.22 y micro; m filtros | Merck, Darmstadt, Alemania | SLGPM33RS |
Referencias
- Lichty, B. D., Breitbach, C. J., Stojdl, D. F., Bell, J. C. Going viral with cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (8), 559-567 (2014).
- Cassady, K. A., Haworth, K. B., Jackson, J., Markert, J. M., Cripe, T. P. To Infection and Beyond: The Multi-Pronged Anti-Cancer Mechanisms of....
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Reimpresiones y permisos
